Mutagénèse dirigée

La mutagenèse dirigée est utilisée pour substituer, déléter ou ajouter un petit nombre d’acides aminés. Pour cela nous avons utilisé le kit QuickChange Mutagenesis site-directed de Stratagene. Les amorces ont été conçues avec le serveur PrimerX (http://www.bioinformatics.org/primerx/cgi-bin/protein_1.cgi) dont les paramètres par défaut ont été modifiés: le pourcentage de G/C doit être compris entre 30% à 60%, la longueur de 25 à 70 pb, le Tm de la région appariée compris entre 50 et 55°C, et il est également préférable que

l’oligonucléotide se termine par un nucléotide G ou C (ce qui évite des appariements non spécifiques). La température de déshybridation des brins doit-être comprise entre 75 et 85°C. On prépare le mix réactionnel suivant : 5 µL de « 10X reaction buffer » auquel on ajoute 25 ng d’ADN, 15 pmoles de chacun des oligonucléotides (voir Tableaux MM-4 et MM-5), 0,2 mM de dNTP mix (Agilent) et H2O pour compléter à 49 µL. On ajoute alors 1 μL de PfuUltra HF

DNA polymerase (concentration initiale 2,5 U/μl, Agilent). Une première incubation de 1 min à 95°C est réalisée, suivie du programme PCR suivant : 45 sec à 95°C pour désapparier les brins d’ADN, puis 1 min à 55°C pour hybrider les amorces sur l’ADN et enfin 9 min à 72°C pour permettre à la polymérase de répliquer le plasmide ; 18 cycles de PCR sont nécessaires pour obtenir le matériel final. A la fin des 18 cycles, une dernière incubation de 10 min à 72°C est réalisée. On ajoute ensuite 1µL de l’enzyme DpnI (Thermofisher Scientific) qui permet de digérer les brins matrices méthylés qui n’ont pas incorporé les mutations. L’incubation se fait durant 2h à 37°C. Les plasmides sont alors utilisés pour transformer la souche bactérienne NEB turbo. Les clones obtenus sont mis en préculture afin de réaliser une extraction plasmidique et un séquençage des plasmides par l’entreprise GATC Biotech.

Tableau MM-4 : Couples d’amorçes utilisés pour la mutation des résidus V132T133I134 de Vp16PDF avec

hélice.

Constructions Séquences des amorces

Vp16PDF(VTI)hélice CTGAACGGCGTAACGATAATGGATTATCTGAGTCCGCTG CAGCGGACTCAGATAATCCATTATCGTTACGCCGTTCAG

Vp16PDF(VTF)hélice CTGAACGGCGTAACGTTTATGGATTATCTGAGTCCGCTG CAGCGGACTCAGATAATCCATAAACGTTACGCCGTTCAG

Les séquences des amorces (ThermoFisher Scientific), dans les sens « forward » puis « reverse », sont présentées de 5’ en 3’. Les nucléotides correspondant aux acides aminés mutés sont représentés en rouge.

Matériels et Méthodes

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Tableau MM-5 : Couples d’amorçes utilisés pour la mutation des résidus 141 à 143 d’EcPDF wt.

Constructions Séquences des amorces

EcPDF(KLI) CACCTGGTCGGCAAACTGATTATGGATTATCTGTCACC GGTGACAGATAATCCATAATCAGTTTGCCGACCAGGTG

EcPDF(VTI) CACCTGGTCGGCGTCACCATC ATGGATTATCTGTCACC CAGCGGTGACAGATAATCCTAGATGGTGACGCCGACCAGG

EcPDF(KLF)ΔC-ter CCTGGTCGGC_{CAGCGGTGACAGATAATCCTA}AAACTGTTTTAGGATTATCTGTCACCGCTG _{AAACAGTTTGCCGACCAGG}

EcPDF(KLI)ΔC-ter GATGGATCACCTGGTCGGC_{GTTGTTTCAGCGGTGACAGATAATCCTA}AAACTGATC_GATCAGTTTTAGGATTATCTGTCACCGCTGAAACAAC _{GCCGACCAGGTGATCCATC}

EcPDF(VTI)ΔC-ter

CAGCATGAGATGGATCACCTGGTCGGCGTCACCATCTAGGATTATCTGTCACCGCT GAAACAAC

GTTGTTTCAGCGGTGACAGATAATCCTAGATGGTGACGCCGACCAGGTGATCCATC TCATGCTG

Les séquences des amorces (ThermoFisher Scientific), dans les sens « forward » puis « reverse », sont présentées de 5’ en 3’. Les nucléotides correspondant aux acides aminés mutés sont représentés en rouge.

3) Sous-clonage des gènes des chimères de Vp16PDF présentes

dans le plasmide pBAD vers le vecteur pET-16b

Les gènes des protéines chimériques étaient initialement présents dans un plasmide pBAD, utilisé pour réaliser les tests de complémentation fonctionnelle (voir plus loin). Cependant, afin de pouvoir surexprimer les protéines et les purifier, il a été nécessaire de sous- cloner ces gènes dans un plasmide d’expression, permettant d’obtenir des quantités plus importantes de protéines. Les gènes ont donc été sous-clonés dans le vecteur pET-16b (Novagen, carte du plasmide en annexe).

Le mélange réactionnel pour l’amplification par PCR est le suivant : 3 ng de plasmide, 50 pmoles de chacun des oligonucléotides (voir Tableau MM-6), 1 mM de dNTP (Agilent), 5 µL de tampon de réaction 10X, 1 µL de Pfu DNA polymerase (Agilent, 2,5 unités/µL) dans 50 µL final. Le programme PCR se compose d’une étape de dénaturation à 95°C durant 1 min, puis 1 min d’hybridation à 55°C et une étape de synthèse à 72°C durant 2 min. On réalise 30 cycles de dénaturation/hybridation/polymérisation, et à la fin des cycles, une dernière incubation de 10 min à 72°C est réalisée. Les amorces utilisées pour amplifier les gènes (voir Tableau MM- 6) insèrent des sites BspHI et XhoI aux extrémités 5’ et 3’ respectivement. On purifie les produits de PCR avec un kit spécifique (QIAquick PCR purification kit de Qiagen). Une fois purifiés, les produits de PCR sont alors digérés par les enzymes BspHI et XhoI, durant 20 min à 37°C. Le plasmide vide pET-16b est digéré avec l’enzyme XhoI ainsi qu’avec l’enzyme NcoI qui génère des extrémités compatibles avec celles générées par BspHI. Pour la ligation, nous

Matériels et Méthodes

152 avons utilisé 300 ng de pET-16b digéré, 220 ng de produit de PCR purifié et digéré, 2 µL de T4 DNA ligase (Invitrogen, 1 unité/µL) et 2 µL de tampon 10X dans un volume finale de 20 µL. Les échantillons sont incubés à 22°C durant 4h. Suite à la ligation, le produit de réaction est transformé dans des bactéries thermocompétentes DH5α (voir protocole de transformation). Les clones obtenus sont alors criblés par PCR. Pour cela, nous réalisons pour chaque colonie une réaction de 25 µL final, comprenant 1,5 µL de tampon 10X, 0,2 mM de dNTP, 2 mM MgCl2, 1 µL d’amorce T7 promoteur et T7 terminateur à,4 pmol/µL et 0,1 µL de Taq

Polymerase (Eurobio Taq, 0,5U ). Le mix est tout d’abord préparé dans un volume final de 15 µL. En parallèle une colonie du clone à cribler est piquée avec une pointe et mélangée dans 10 µL d’eau (on repique également ce clone sur boîte LB agar contenant 25 µg/mL d’ampicilline que l’on incube la journée à 37°C). On ajoute ensuite les 10 µL contenant la colonie diluée dans le mix PCR de 15 µL, pour obtenir un volume finale de réaction de 25 µL. On utilise ensuite le programme PCR suivant pour amplifier le plasmide présent dans la colonie : 3 min à 94°C pour désapparier les brins d’ADN, puis des cycles comprenant 30 sec à 94°C, 30 sec à 52°C pour hybrider les amorces sur l’ADN et enfin 3 min à 72°C pour permettre à la polymérase de répliquer le plasmide. Il faut réaliser 30 cycles de PCR pour obtenir le matériel final. A la fin des 30 cycles, une dernière incubation de 10 min à 72°C est réalisée. Le produit de PCR est alors analysé sur gel d’agarose 1%. Les clones positif sont alors mis en préculture dans 5 mL de milieu LB liquide avec 25 µg/mL d’ampicilline et incubés la nuit à 37°C. On réalise le lendemain une extraction des plasmides (voir extraction de plasmide avec le kit miniprep). Les ADN purifiés sont alors envoyés à l’entreprise GATC Biotech pour être séquencés.

Tableau MM-6 : Couples d’amorces permettant le transfert des gènes codant les chimères de

Vp16PDF du plasmide pBAD/Myc-HisA vers le vecteur pET-16b .

Constructions Séquences

Vp16PDF(KLF)hélice TACGACTC_ACCTGTCTCGAGATGAAAATCCTGAAAGATGATGCACCGG _{TTATTAGGCACGTGCTTTCAGACG} Vp16PDF(VTI)hélice TACGACTC_ACCTGTCTCGAGATGAAAATCCTGAAAGATGATGCACCGG _{TTATTAGGCACGTGCTTTCAGACG} Vp16PDF(VTF)hélice TACGACTC_ACCTGTCTCGAGATGAAAATCCTGAAAGATGATGCACCGG _{TTATTAGGCACGTGCTTTCAGACG}

Les séquences des amorces, dans les sens « forward » puis « reverse », sont présentées de 5’ en 3’. Les sites de restriction sont soulignés. Les codons d’initiation et de terminaison sont indiqués respectivement en rouge et vert.

Matériels et Méthodes

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