• Introduction et limites des méthodes actuelles
L’étude de la physiologie du grain d’amidon présente un intérêt à la fois scientifique et industriel. Un ensemble d’approches permet donc d’étudier l’impact, notamment de mutations génétiques, sur ces phénotypes (figure 38). Différents paramètres seront alors étudiés comme la taille des grains, ainsi que leur forme. D’autres éléments comme le nombre de grains d’amidon par plastes ou la taille des plastes peuvent s’avérer pertinents. Un ensemble de méthodes a alors été développé combinant les avantages de méthodes basées sur l’extraction des grains d’ami- don ou sur la réalisation de coupes afin d’étudier les grains d’amidon in situ. Seul le traitement au lugol de racines d’Arabidopsis peut être appliqué directement sans traitement préalable des racines, si les plantes sont suffisamment jeunes (moins de 3 semaines selon nos observations).
Figure 38. Illustrations de différentes méthodes d’observation du grain d’amidon dans les feuilles et les racines d’Arabidopsis Thaliana. L’observation des grains peut nécessiter l’isolement des cellules végétales
de feuilles d’Arabidopsis Thaliana (1) ou l’extraction des grains d’amidon (2) pour une observation en
microscopie DIC (taille de l’image 72µmx72µm). Les grains d’amidon peuvent également être mesurés à l’aide d’un compteur de particule (3) qui permettra une comparaison rapide de plusieurs milliers de grains entre différentes conditions (sauvage en bleu, mutants en rouge et vert) au détriment de la mor- phologie des grains ou de leurs nombres et localisations par plastes. Les observations réalisées sur coupes permettent d’obtenir ces informations complémentaires en microscopie électronique (4, taille de l’image 42µmx42µm) ou optique(5, coloration de l’amidon au lugol sur coupe observée en lumière blanche réalisée sur un tubercule de pomme de terre). Pour des plantes de moins d’Arabidopsis âgées de moins de 15 jours,
Chaque méthode présente des avantages et des limites :
i) Les méthodes basées sur les extractions de grains nous offrent une vision statistique rapide de la taille des grains d’amidon. Le compteur de particules permet ainsi d’analyser 30000 grains/mn, mais ne donne aucune information quant à la géométrie des grains ou au nombre de grains par plastes.
ii) L’imagerie DIC (Differential interference contrast) quant à elle donne un bon aperçu de la forme des grains, mais ces derniers subissent des contraintes mécaniques fortes qui ont tendance à déformer les plus gros grains. De plus, la détection automatique des grains n’est pas simple, ce qui limite les possibilités de quantification. Dans les deux cas, aucune information sur les propriétés du plaste n’est disponible. L’isolement de cellules végétales complètes fournit une partie de cette information, mais on se retrouve cette fois face aux limites de l’imagerie DIC sur des objets épais et la différence entre grains d’amidon et plastes n’est pas toujours triviale, et ce, même pour des yeux experts. En toute hypothèse, aucune quantification ne semble possible avec de telles images.
iii) Les coupes de feuilles permettent, quant à elles, une visualisation précise des grains d’amidon dans les plastes et dans la cellule. Cependant, les traitements appliqués ainsi que les méthodes de fixation peuvent encore une fois déformer nos différentes structures. Un autre point crucial à prendre en compte est que nos différents objets sont complètement anisotropes. Ainsi, une coupe ne sera pas nécessairement représentative de l’objet dans son ensemble. L’ob- tention de représentation tridimensionnelle nécessite alors l’observation de nombreuses coupes sériées et leur reconstruction, très complexe à réaliser sur un grand nombre d’échantillons.
La solution technologique idéale pour ce type d’étude serait donc une méthode d’acquisi- tion in situ, rapide et non invasive, sans déformation de l’échantillon, et rendant compte de sa structure tridimensionnelle. Tout biophotonicien pensera alors immédiatement à la microscopie confocale (ou à la microscopie multiphotonique). L’amidon n’est cependant pas fluorescent, à la différence de tous les autres constituants du plaste. Nous avons donc choisi de caractériser spectralement notre échantillon et de développer une méthode d’imagerie négative du grain d’amidon qui s’est avérée particulièrement efficace.
• Mesures en fluorescence négative
Nos observations spectrales des feuilles d’A.thaliana nous ont permis, conformément à la littérature (Roshchina, 2012), de déterminer 3 bandes spectrales d’émission d’autofluorescence i) en bleu pour un maximum d’émission à 450nm (azulènes et phénols) ii) en vert, pour un maximum à 550nm (caroténoïdes) et en rouge, pour un maximum à 680nm (chlorophylle). Une analyse plus précise du différentiel entre le « non-signal » des grains d’amidon, et les signaux environnants nous ont permis de limiter la procédure à une analyse à deux canaux vert et rouge. Nous avons alors appliqué cette approche à des feuilles d’A.thalliana prélevées en fin de jour (moment ou la feuille accumule le plus d’amidon) et pour des raisons pratiques, fixées au para- formaldehyde. Nous nous sommes appuyés sur la collection de mutants de l’équipe « glycobio- logie végétale » présentant des phénotypes de tailles et de formes de grains d’amidon, mais également de chloroplastes et qui ont été précédemment caractérisés par différentes méthodes au laboratoire (tableau 3 et figure 39). Dans cet exemple, nous nous sommes focalisés sur l’éco- type Col0 sauvage, ou dépourvu de l’amidon synthase de type 4 (SS4, impliquée dans la synthèse de l’amidon), et/ou la filamentous temperature sensitive protein Z (ftsz1 et 2.1, impliquée dans la division des plastes).
Figure 39 : application de notre stratégie de mesure en fluorescence négative sur des feuilles d’Arabi-
dospis thaliana, âgées de 2 semaines, sauvage (Col0) et simple (ss4, ftsz1, ftsz2.1) et double mutant (ss4/ ftsz1, ss4, ftsz2.1). Cette méthode, rapide et peu invasive permet une caractérisation rapide de la morpho-
logie des plastes et des grains d’amidons.
Nombre de grains Taille des grains Taille des plastes Col0 (sau- vage) ++ + + ss4 + +++ + ftsz1 +++ + +++ ftsz2.1 +++ + +++ ftsz1-ss4 +++ +++ ++++ ftsz2.1-ss4 +++ +++ ++++
Tableau 3: phénotypes attendus pour les différentes feuilles d’Arabidospis thaliana utilisées pour valider