PRINCIPES DE L’ANALYSE DE PATERNITE

Toutes les procédures qui aboutissent à la détermination des pères, pour chaque descendant étudié dans notre échantillon, sont réalisées à partir du Logiciel FaMoz développé par le Laboratoire d'Amélioration Génétique Forestière de l'INRA (Gerber et al. 2000). Ce programme permet d’effectuer les analyses de parenté selon que l’on recherche les deux parents ou le père en connaissant la mère. Les étapes de l’analyse sont les suivantes :

Tableau 15. Probabilités d’exclusion de paternité dans un système à 2 allèles codominants Couples mère-enfant Probabilités Pères incompatibles Probabilités Probabilités

d’exclusion AA.AA p3 aa q2 p3q2 AA.Aa p2q AA p2 p4q Aa.AA p2q aa q2 p2q3 Aa.Aa pq -- -- -- Aa.aa pq2 AA p2 p3q2 aa.Aa pq2 aa q2 pq4 aa.aa q3 AA p2 p2q3

La probabilité d’exclusion est calculée par la somme de la dernière colonne

q p q p q p q p q p q p EP = 3 2 + 4 + 2 3 + 3 2 + 4 + 2 3

locus ;

- calcul des probabilités d'exclusion ;

- calcul des LOD scores des pères potentiels pour la désignation du ou des pères les plus probables ;

- simulations de populations de descendants à partir de tirages aléatoires dans la population parentale, afin de déterminer les seuils critiques de décision par rapport aux LOD scores ;

- estimation du flux de gènes caché.

5.2.1. Probabilité d'exclusion

La probabilité d’exclusion (EP pour « exclusion probability ») désigne la capacité d’un marqueur génétique à exclure une relation entre deux ou plusieurs individus et détermine donc l'efficacité des analyses de parenté. Elle est calculée à partir des fréquences alléliques de la population parentale. Le calcul des probabilités d'exclusion, pour des marqueurs codominants (microsatellites), se réfère aux travaux de Jamieson et Taylor (1997). Trois types de probabilités d'exclusion peuvent être calculés : i) le plus courant concerne la recherche en paternité quand la paire mère-descendant est comparée avec un père potentiel ; ii) le second compare un parent à un descendant en n’ayant aucune information sur l’autre parent ; iii) le troisième s’effectue quand une paire de parents est comparée au descendant. Dans notre cas, la démarche est de déterminer, parmi une population de géniteurs connus, le père d’un descendant à partir de son génotype multilocus et de celui de sa mère. Un exemple pour un locus bi-allélique d’un marqueur codominant est donné dans le tableau 15.

La probabilité d’exclusion pour des marqueurs codominants EP_l à un locus donné l est calculée selon la formule suivante (Jamieson et Taylor 1997) :

EP_l = 1-2a₃+a₃+3(a₂a₃-a₅)-2(a²₂-a₄)

où a_k =

∑

p et p_i est la fréquence de l’allèle i au locus l.

Dans le cas de L loci multialléliques et indépendants, et dans une population panmictique en équilibre, la probabilité d’exclusion totale est calculée par :

Deuxième chapitre – Matériels et Méthodes

(

)

5.2.2. Calcul des LOD scores

Quand il est impossible d’exclure tous les pères pour n’en garder qu’un seul, nous passons par une étape supplémentaire. L'objectif est d’attribuer une probabilité aux pères potentiels à partir des données moléculaires des descendants étudiés et de leurs mères respectives. Le calcul des LOD scores (logarithme d’un rapport de vraisemblances) pour tous les pères potentiels, est basé sur le rapport entre le maximum de vraisemblance d'un géniteur mâle parmi la population des géniteurs mâles connus pour le couple descendant-mère donné et le maximum de vraisemblance s’ils ne sont pas apparentés. Les pères potentiels sont classés selon leurs valeurs de LOD scores respectives, dont le principe de calcul est décrit ci-après.

La vraisemblance (L) d’une hypothèse (H) pour un type de donnée (D) s’écrit L(H│D). La vraisemblance pour une hypothèse est évaluée par rapport à son alternative, soit le ratio de vraisemblance :

L(H₀,H₁│D) = P(D│H₀)/P(D│H₁)

où P(D│H_i) est la probabilité d’obtenir D sous l’hypothèse H_i.

Soit g_m, g_a et g₀ qui sont, respectivement, les génotypes de la mère (connue), du père supposé et du descendant à un locus. Pour chaque candidat père, deux hypothèses alternatives sont possibles : (H₀) le candidat est le vrai parent ; (H₁) le candidat n’est pas le vrai parent. La vraisemblance que la mère et le père soient les parents du descendant s’exprime par :

L(H₀│g_m,g_a,g₀) = T(g₀│g_m,g_a).P(g_m).P(g_a)

où T(g₀│g_m,g_a) est la probabilité du génotype d’un descendant donné selon les génotypes de la mère et du père supposé sous l’hypothèse mendélienne. P(g_m) et P(g_a) sont les fréquences des génotypes des deux parents dans la population.

La vraisemblance que le père soit choisi au hasard : L(H₀│g_m,g_a,g₀) = T(g₀│g_m).P(g_m).P(g_a)

Le ratio de vraisemblance est donc :

L(H₀,H₁│g_m,g_a,g₀) = T(g₀│g_m,g_a).P(g_m).P(g_a)/T(g₀│g_m).P(g_m).P(g_a) = T(g₀│g_m,g_a)/ T(g₀│g_m)

obtenus pour chaque locus, on parle alors de LOD score.

5.2.3. Simulation et seuils critiques

Compte tenu du mode de pollinisation, la population étudiée ne peut pas être considérée comme isolée. Les arbres adultes génotypés ne représentent qu’un sous-ensemble des parents mâles participant à la descendance. Quant la paternité ne peut être attribuée à aucun des génotypes parentaux connus, on considère que le gamète mâle provient de l’extérieur de la parcelle. Le flux de gènes total (GF : Gene Flow) peut donc être subdivisé en deux composantes différentes : le flux de gènes venant de l’extérieur du verger (GFO : Gene Flow Outside) et le flux de gènes à l’intérieur de celui-ci (GFI : Gene Flow Inside). Le GFO, estimé à partir de l'analyse de paternité, est probablement sous évalué car certains gamètes extérieurs sont indiscernables des gamètes internes à la parcelle correspondant ainsi à un flux de gènes cryptique (ou flux de gènes caché). En utilisant les génotypes des 349 géniteurs au 6 loci microsatellites, deux jeux de 10 000 descendants sont générés à partir des fréquences alléliques en considérant l’autofécondation possible. Dans le premier jeu, les descendants sont générés aléatoirement à partir des allèles parentaux (seuls les génotypes parentaux sont possibles). Dans le deuxième jeu, chaque descendant est généré aléatoirement à partir des fréquences alléliques de la population parentale (tous les génotypes sont possibles). Ces simulations intègrent un taux d'erreur de 0,1% dans les données. Le principe consiste à remplacer dans l’échantillon, dans les limites du taux fixé, un allèle à un locus par un autre allèle tiré au hasard en fonction de la fréquence de chaque allèle à ce locus. Pour construire les tests statistiques et décider si un père peut être le vrai père, nous comparons les distributions des LOD scores du père le plus probable des descendants du jeu 1 à celui des descendants du jeu 2. Les LOD scores obtenus du jeu 1 représentent la distribution sous l’hypothèse nulle H₀ que le père est présent dans les individus génotypés tandis que les LOD scores du jeu 2 représentent la distribution sous l’hypothèse alternative H₁ que le père n’existe pas dans la population de géniteurs connus. L'erreur de type I (α, on rejette H_o alors que c’est vrai) est réalisée quand aucun des pères génotypés n'a été assigné à un descendant du jeu 1. L’erreur de type II (β, on accepte H_o alors que c’est faux) correspond au fait qu'un père génotypé est assigné à un descendant du jeu 2. Les niveaux de ces deux types d'erreurs dépendent de la valeur du seuil choisi du LOD score. Ce seuil permet de prendre les décisions suivantes : i) on garde H_o quand le LOD score est au-dessus de ce seuil et on rejette H_o s’il est inférieur. Afin de minimiser les deux types d'erreur et de connaître leur importance, le seuil est choisit à l'intersection des distributions

Figure 29. Distributions des LOD scores pour les deux populations simulées de descendants (en pointillé,

la population simulée à partir des fréquences alléliques, en continu la population simulée à partir du tirage au hasard des allèles présents dans la population parentale, détermination du seuil au croisement des deux courbes, α : erreur de

type 1, β : erreur de type II)

α β 0 200 400 600 800 1000 1200 0 5 10 15 20 LOD-scores no m b re d' in di vi du s GFI GFO

des jeux 1 et 2.

Pour tester la qualité des résultats précédents, nous simulons une population vraie où chaque descendant pourrait avoir 0, 1 et 2 parents parmi les parents génotypés. Nous générons ainsi 10 000 descendants en choisissant leurs parents au hasard parmi une population de 500 individus auxquels sont inclus les 349 parents du verger. Les allèles sont choisis au hasard sous la contrainte de leur fréquence dans la population réelle. Pour chaque descendant, nous effectuons les mêmes tests que précédemment en considérant que chaque parent ayant un LOD score supérieur au seuil prédéterminé est considéré comme un père probable. Les résultats sont comparés pour la population réelle et la population vraie. Nous déterminons ainsi : i) le GFO vrai c’est à dire le nombre de fois ou un père extérieur à la parcelle est attribué aux descendants ; ii) le GFO apparent le nombre de fois ou aucun père du verger n’est détecté dans la population simulée de descendants ; iii) et le « cryptic gene flow » ou flux de gène caché, c’est à dire la probabilité de confondre un père dans le verger avec un père n’appartenant pas à celui-ci.

5.2.4. Particularité et applications à notre échantillon

Sur les 851 descendants étudiés, 127 présentaient un génotype moléculaire incompatible avec celui de la mère dont ils étaient théoriquement issus et ce quel que soit le locus. L’origine de ces problèmes d’identification demeure inconnue et les erreurs de manipulations sont possibles depuis la récolte jusqu’au dépôt sur les gels d’acrylamide. La source d’erreur la plus probable vient des travaux en pépinière ou les planches de semis pour nos échantillons étaient contiguës avec d’autres lots de graines non utilisés.

La figure 29 montre la distribution des LOD scores dans les populations de descendants générées par les deux simulations. L’intersection de ces courbes nous permet de fixer un seuil de LOD score et de représenter les erreurs de type I et II. Dans notre cas, le seuil choisi est de 5. Au-dessus de cette valeur, nous retenons le père ayant la valeur de LOD score la plus élevée parmi les différents candidats. Si celui de tous les candidats est inférieur au seuil nous n’en retenons aucun et nous considérons que le père n’appartient pas au verger.

Deuxième chapitre – Matériels et Méthodes