Principe du test anti-inflammatoire

Le test anti-inflammatoire réalisé est basé sur l’inhibition de la sécrétion du TNF-α. L’ajout de lipopolysaccharide (LPS) issu de Salmonella abortus equi (Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne) dans le milieu cellulaire va entrainer un relargage de TNF-α par les cellules, ces dernières sont dites « activées ». La présence de TNF-α dans le milieu cellulaire est suivi par cytométrie en flux à l’aide d’anticorps spécifiques (TNF-α secretion assay, Miltenyi Biotech, États-Unis). Un premier complexe d’anticorps (anticorps I ou anticorps de capture) composé d’un anticorps monoclonal anti-TNF-α (IgG1 souris) conjugué à un anticorps monoclonal spécifique à la surface cellulaire (IgG2a souris) va permettre la capture et la fixation du TNF-α à la surface de la cellule. Puis un anticorps monoclonal anti-TNF-α (IgG1 humain) conjugué à la R-phycoérythrine (PE) (anticorps II ou anticorps de détection) va se fixer sur le TNF-α fixé au premier complexe d’anticorps et ainsi permettre la détection du TNF-α par cytométrie en flux (FIGURE II - 18).

Fluorescence 1 Fluorescence 2 Fluorescence 3 Laser 90 °C Miroir dichroïque Filtre Fluorescence verte Fluores cence rouge SSC FSC Échantillon

FIGURE II - 18 - Principe du test anti-inflammatoire basé sur l'inhibition de la sécrétion du TNF-α

La R-phycoérythrine (PE), extraite d’algues rouges, absorbe à 496, 546 et 565 nm et émet à 578 nm correspondant à une fluorescence jaune. En mesurant la fluorescence jaune à la surface de la cellule par cytométrie en flux, il est possible d’étudier l’inhibition de la sécrétion du TNF-α par les extraits de plantes. Une forte fluorescence jaune correspond à une forte concentration en TNF-α et donc à aucune activité anti-TNF-α ou anti-inflammatoire de l’extrait. Inversement, une absence de fluorescence jaune correspond à une absence de TNF-α dans le milieu cellulaire et donc à un pouvoir anti-inflammatoire de l’extrait testé. Une autre molécule fluorescente, l’iodure de propidium, est introduite dans le milieu cellulaire afin d’évaluer simultanément la toxicité des extraits. L’iodure de propidium est un agent intercalant de l’ADN et ne pénètre dans la cellule uniquement lorsque la membrane plasmique est endommagée, ce fluorochrome permet d’étudier la mort cellulaire par intégrité membranaire. Une fois le colorant lié à l’ADN, l’iodure de propidium absorbe à 535 nm et émet à 617 nm correspondant à une florescence rouge. En mesurant la fluorescence rouge émise à la surface de la cellule par cytométrie en flux, il est possible de mesurer le pourcentage de mort cellulaire. Ainsi la toxicité des extraits peut être évaluée et la mesure de leur activité anti-inflammatoire peut être basée uniquement sur les cellules vivantes en écartant les cellules mortes marquées à l’iodure de propidium.

Le test anti-inflammatoire est réalisé sur plaque 96 puits. Dans chaque puit sont ajoutés :

- 180 µL de cellules à une concentration de 3 x 10⁵ cellules/mL dans du milieu RPMI-1640 complet

- 20 µL de chaque extrait dans un mélange 90/10 eau/éthanol (concentration finale d’éthanol dans le puits au contact des cellules de 1 %)

- 20 µL de LPS à 10 µg/mL (concentration finale dans le puit de 1 µg/mL)

La plaque est mise à incuber pendant 2 heures à 37 °C sous atmosphère humide contrôlée à 5 % de CO₂. Après incubation, 2 µL de l’anticorps I (anticorps de capture) ainsi que 2 µL de l’anticorps II (anticorps de détection) sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est remise à incuber pendant 2 heures dans les mêmes conditions que précédemment (37 °C, 5 % CO₂). 2 µL d’iodure de propidium à 100 µg/mL (concentration finale dans le puits de 1 µg/mL) sont ajoutés à chaque puits et la plaque est mise à incuber (37 °C, 5 % CO) une dernière fois pendant 10 min avant l’analyse par cytométrie en

+ LPS + Anticorps I + Anticorps II

TNF - α

R-phycoérythrine (fluorophore jaune)

Cellule non « activée »

Sécrétion du TNF – α hors de la cellules Cellule « activée »

Capture du TNF – α par l’anticorps I fixé sur la cellule

Fixation de l’anticorps II sur le TNF – α fixé par

flux. Le cytomètre utilisé est un Guava® easyCyteTM 12HT (Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne). Cet appareil ne dispose pas d’un système de liquide de gaine pour aligner les cellules mais d’un micro-capillaire. Dans ce système, une cellule fluidique micro-capillaire carrée en quartz remplace le liquide de gaine. Le micro-capillaire étant carré, le flux est rapide au centre mais fortement ralenti aux quatre coins du capillaire permettant ainsi la focalisation hydrodynamique des cellules après un parcours de 8 cm avant passage devant les rayons lasers (FIGURE II - 19).

FIGURE II - 19 - Focalisation hydrodynamique dans un micro-capillaire

Le système de cytométrie en flux micro-capillaire permet de travailler avec des micro volumes d’échantillon (50-100 µL) contrairement au système classique présenté précédemment qui nécessite une dizaine de mL par analyse. Cela permet de disposer d’un comptage direct des cellules dès que ces dernières passent devant le laser. Le laser utilisé est un laser bleu de longueur d’onde d’excitation de 488 nm. La source d’excitation lumineuse doit permettre une illumination des colorants à une longueur d’onde proche de leur maximum d’absorption (496 nm pour la R-phycoérythrine et 535 nm pour l’iodure de propidium). La vitesse de flux moyenne utilisée est de 35 µL/min. Avant prélèvement de l’échantillon par le micro-capillaire, les cellules sont remises en suspension à l’aide d’un agitateur rotatif pendant 10 secondes. Entre chaque échantillon, le capillaire ainsi que l’agitateur sont nettoyés. Les données obtenues sont traitées à l’aide du logiciel GuavaSoft (InCyte 3.1.1.).

Un contrôle négatif est réalisé en déposant 180 µL de cellules mais sans LPS afin de ne pas les activer. Un contrôle positif du relargage du TNF-α est réalisé en activant les cellules avec le LPS mais sans rajouter l’extrait afin de mesurer la sécrétion du TNF-α sans interférences avec la présence de l’extrait. Un deuxième contrôle positif correspondant à l’inhibition de la sécrétion du TNF-α par un anti-inflammatoire connu est réalisé en déposant la molécule anti-inflammatoire sur les cellules activées à la place de l’extrait. Le célastrol, un triterpénoïde naturel, a été utilisé comme contrôle

Laser Cellules Échantillon Micro-capillaire Poubelle Flux de l’échantillon

positif de l’activité anti-inflammatoire a une concentration de 0,5 µM finale dans le puits au contact des cellules. Le célastrol inhibe la sécrétion de cytokines pro-inflammatoire in vitro et en particulier celle de TNF-α [20].