Complexe du NHEJ Protéines procaryotes Protéines eucaryotes
DNA-PK YkoV (Ku) Ku70/80
DNA-PKcs
Maturation Artemis
TdT
Figure 6 : Structure de l'hétérodimère Ku70/Ku86 lié à l'ADN sous deux angles différents. On observe facilement la structure en anneau qui encadre l'ADN La partie Cter de Ku80 n'apparait pas. Ku70 est en jaune, Ku80 en rouge et l'ADN en gris (Walker et al., 2001)
L’hétérodimère Ku70/80 est un des acteurs majeurs du NHEJ, il a été décrit comme une
plate forme pour le recrutement des acteurs de la voie (Weterings and Chen, 2008). L'hétérodimère Ku a été initialement identifié comme un autoantigène présent dans le sérum de patients souffrants de maladies autoimmunes (MIMORI et al., 1981). La purification de cet antigène a montré qu'il s'agissait d'un complexe de deux protéines de 86 et 70 kDa (Ku86 et Ku70, respectivement). L’hétérodimère a une très grande affinité pour les extrémités d’ADN double brin, sans spécificité de séquence. Il est nécessaire pour le recrutement de DNA-PKcs au niveau des cassures. La résolution de la structure 3D de la protéine montre que l’hétérodimère forme un anneau qui peut entourer l’ADN et probablement le protéger de la dégradation par des nucléases. La protéine est composée de deux sous unités relativement symétriques, elles mêmes divisées en trois grands domaines (figure 6) (Walker et al., 2001). L’association des domaines centraux β barrel des deux sous unités forme le berceau qui va encadrer l’ADN.
Les domaines αβ ne sont pas ou très peu impliqués dans l’interface entre les deux sous-unités ou dans l’interaction avec l’ADN, mais il est supposé que ces domaines sont importants pour les interactions avec d’autres protéines de réparation.
Les domaines Cter des deux sous unités diffèrent beaucoup. Celui de la protéine Ku80 forme un long bras moins structuré que le cœur, qui pourrait interagir avec d’autres protéines. Par exemple, l’extrémité du Cter de Ku80 interagit avec la protéine DNA-PKcs et la présence d’un motif spécifique au niveau des acides aminés terminaux est une signature de la présence de DNA-PKcs dans l’organisme considéré (Singleton et al., 1999). La délétion du Cter de Ku80 n’abolit pas le recrutement de DNA-PKcs au niveau des extrémités cassées, mais l’activité kinase de DNA-PKcs est réduite in vivo. Le Cter de Ku70 est plus court et pourrait être impliqué dans les interactions avec l’ADN. De nombreuses analyses des interactions de
Figure 7 : Structure de la DNA-PKcs et de son domaine kinase. Modélisation du domaine catalytique de la DNA-PKcs. Les différentes couleurs représentent les différents domaines. (Ochi et al., 2010).
Ku ont été menées in vitro et ont montré que l’hétérodimère est capable d’interagir avec le complexe de ligation XRCC4/LigIV/XLF. Récemment, une analyse in vitro a montré que Ku avait une activité 5’-dRP/AP lyase, qui peut exciser les sites abasiques avec une forte efficacité lorsqu’ils se trouvent au niveau d’une extrémité sortante 5’ d’une cassure double brin. Cela suggère que Ku pourrait être impliqué dans la maturation des cassures et important pour la fidélité de la voie NHEJ (Strande et al., 2012).
Il a été observé que Ku était impliqué dans l’addition et la maintenance des télomères au niveau des extrémités de chromosomes. Cet aspect sera abordé plus loin(Slijepcevic and Al-Wahiby, 2005).
DNA-PKcs, la sous unité catalytique de la protéine kinase dépendante de l’ADN, est une
grosse protéine de 4128aa qui interagit avec Ku et l’ADN pour former le complexe DNA-PK. Comme son nom l’indique, cette protéine a une activité kinase (figure 7) et possède de très nombreuses cibles, dont elle-même. Son autophosphorylation semble jouer un rôle dans le changement de conformation du complexe DNA-PK, qui pourrait permettre l’accès de protéines de maturation des extrémités au niveau des cassures double brin ((Budman et al., 2007; Goodarzi et al., 2006). Le rôle précis de la DNA-PKcs est encore peu clair, elle semble avoir de multiples rôles dans la cellule. Elle est nécessaire pour la recombinaison V(D)J. Un KO de cette protéine chez la souris produit des souris immunodéficientes.
Le complexe de Ligation LigIV/XRCC4/XLF est responsable de l’étape finale de la
réparation par la voie NHEJ. Il va permettre la ligation des deux extrémités d’ADN au niveau de la cassure. Il est formé de trois protéines dont seule la LigIV possède une activité catalytique (Ahnesorg et al., 2006; Barnes et al., 1998; Grawunder et al., 1997). Chacun des membres du complexe est indispensable pour assurer l’étape de ligation et des KO des
gènes codant ces protéines chez la souris sont létaux au stade embryonnaire. Les protéines XRCC4 et XLF interagissent et peuvent former des filaments qui pourraient favoriser le recrutement du complexe de ligation au niveau de la cassure (Ropars et al., 2011).
Les facteurs de maturation de la voie NHEJ sont encore méconnus. La protéine Artémis est
impliquée dans la recombinaison V(D)J. Il s’agit d’ un type particulier de réparation par NHEJ, est requise pour la résolution des structure en épingle à cheveux générées pendant l’introduction des cassures double brin programmées par les protéines RAG1 et RAG2. (Goodarzi et al., 2006; Ma et al., 2005)
Certaines polymérases de la famille X, les pol λ et pol µ peuvent remplir les gaps pendant le NHEJ. Par exemple, il a été montré chez la levure que la protéine Pol3, est requise pour le comblement de brèches au niveau d’extrémité 3’ sortantes réparées par NHEJ lorsque la Pol4 est absente. Lorsque ces deux protéines sont absentes, il y a une forte réduction de l’efficacité de réparation par NHEJ (Chan et al., 2008).
La TdT est également une polymérase de la famille X, mais a la particularité de ne pas nécessiter de matrice. Elle permet l’addition de nucléotides aux extrémités 3’ de l’ADN. Cette capacité est utilisée dans le test TUNEL qui permet d’ajouter des nucléotides couplés à des fluorophores détectables par microscopie. C’est devenu une technique de routine pour la détection de l’apoptose pendant laquelle l’ADN des noyaux est massivement cassé et dégradé.
In vivo, la TdT est impliquée dans la recombinaison V(D)J, elle permet l’introduction de
variabilité dans ce processus pour augmenter encore la diversité du répertoire immunitaire (Lu et al., 2008).
Figure 8 : Représentation simplifiée du principe de la recombinaison V(D)J permettant la diversité du répertoire immunitaire.