L’idée est de comparer la quantité de streptavidine n’ayant pas réagi lors du greffage à celle mise en solution initialement pour le greffage. L’instrument de mesure est un spectrofluorimètre (SAFAS) , les streptavidines utilisées sont toujours des streptavidine Alexa 555.
Le principe du dosage en retour est décrit dans la figure ci dessous.
Cette mesure, simple en principe, se révèle assez ardue en pratique et les sources d’erreur sont nombreuses.
On utilise des petits volumes d’émulsion (~10µl). Il faut déjà faire attention aux volumes prélevés d’autant que l’aspiration de l’émulsion avec des micropipettes n’est pas identique à l’aspiration de l’eau par exemple. Lorsqu’une pipette aspire 10µl d’eau, elle n’aspirera que 8 ou 9µl d’émulsion. J’ai dû marquer au feutre les niveaux d’émulsion prélevés pour les comparer à des volumes en eau plus juste. On peut estimer l’erreur sur la mesure des volumes à 10%.
Le bruit de mesure spectrofluorimètre n’est pas négligeable. Sur 5 mesures successives, on peut avoir une variabilité de 10% sur les mesures (après de trop nombreuses mesures, il semble y avoir des effets de photobleaching mais sur 5 mesures, cet effet n’est pas visible). La propreté des échantillons est aussi primordiale. Un échantillon sale ou rempli de micelles ou de microgouttelettes va engendrer une diffusion de lumière parasite faussant le signal. Moyennant de nombreuses précautions et de nombreux essais, j’ai donc essayé de tracer la fluorescence du sous-nageant après réaction et de la comparer avec un étalon connu.
Figure 11 : principe du dosage en retour.
La quantité de streptavidine fluorescente dans l’étalon est identique à la quantité de streptavidine fluorescente mise
Les résultats avec la streptavidine furent décevants. Le graphe d’émission de fluorescence du sous-nageant et de l’étalon à la concentration initiale en streptavidine se superposent. On ne peut extraire une quantité de streptavidine ayant réagi.
Nous avons essayé de jouer sur les quantités de streptavidine à l’incubation. En effet, si par exemple nous avions été en net excès de streptavidine par rapport aux biotines disponibles sur la goutte, même dans le cas d’une réaction totale, nous n’aurions pu observer de différence entre la fluorescence du sous-nageant après réaction et la fluorescence de la solution initiale. Mais les recherches de la bonne gamme de streptavidine furent vaines.
Systématiquement, le bruit de la mesure nous empêche d’obtenir des estimations sur la densité de streptavidines adsorbées.
Ceci semble montrer que le rendement de la réaction d’adsorption de la streptavidine sur les gouttes biotinilées est en fait très faible. Ceci est un peu étrange compte tenu de la très forte affinité de la streptavidine pour la biotine en volume. Nous en rediscuterons dans le paragraphe 4.
Nous avons mis au point un autre protocole de dosage en retour en faisant cette fois-ci incuber de la biotine-FITC en présence de l’émulsion fonctionnalisée avec la streptavidine.
I–3-2 : Deuxième tentative : dosage en retour d’une solution de biotine FITC:
Nous avons donc tenté une nouvelle méthode de quantification en venant greffer des biotines fluorescentes sur les streptavidines en surface des gouttelettes puis de quantifier en spectrométrie de fluorescence la biotine n’ayant pas réagie.
Le principe est donc strictement le même que celui décrit dans la figure 1. Mais cette fois-ci, on fait incuber de la biotine fluorescente avec l’émulsion « streptavidinée » et on mesure au spectrofluorimètre la fluorescence des biotines non fixées restant dans les sous nageant. Les résultats furent bien plus convaincants.
La figure 4 est un exemple de spectre de fluorescence obtenu lors de ces manips de dosage en retour.
Dosage retour biotine
0 10 20 30 40 50 60 70 80 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 longueur d'onde (nm) fl u o rescen ce ( u .a. ) ech1 etalon
Figure 12 : spectres d’émission de fluorescence lors d’une expérience de dosage
Dans cette situation, un écart significatif apparaît entre la fluorescence de l’étalon et celle du sous-nageant.
Dans le spectre ci-dessus, on éclaire à 475nm et on récupère la lumière sur la gamme de longueur d’onde en abscisse. Le pic intéressant est le pic à 530 nm (émission du FITC). Pour déterminer la concentration en Biotine-FITC, on fait le rapport entre l’intensité des pics à 530 que l’on multiplie par la concentration connue de l’étalon.
Notons que le bruit de fond mesuré avec le même tampon sans fluorophore est proche de 0. Sur le graphe, on observe une petite proéminence à 565nm. Cette bosse est une émission de fluorescence parasite des streptavidine 555 excitées par la lumière d’excitation (475nm). Je considère que l’effet de cette bosse est négligeable dans la fluorescence du sous-nageant à 530nm,
Ayant déterminé la concentration en biotine-FITC du sous nageant et connaissant les volumes de tampon et d’émulsion introduits, on peut remonter à la quantité de biotine greffée sur les goutteletttes d’émulsion.
Si l’on suppose que la réaction d’adsorption de la biotine sur les streptavidines est totale et que deux biotines sont adsorbées par streptavidine, on peut alors remonter à une estimation de la densité de streptavidine sur les gouttes.
La figure 5 offre une synthèse des dosages effectués dans différentes conditions de fonctionnalisation (le ratio Vstrep/Vémulsion varie).
800 600 400 200 0 Densité d e s tr ep s ur gout tes ( /µm² ) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
Conditions d'incubation Vstrep/Vémulsion
Ce dosage en retour aura permis de se convaincre de l’ordre de grandeur de la densité de streptavidine. D’ailleurs les valeurs estimées concordent bien avec les estimations de Jacques
Figure 19 : Mesure quantitative de la densité de streptavidine sur les gouttes selon les conditions
qui trouvait une densité maximale de 400/µm² et descendait aussi à des valeurs faibles de l’ordre de quelques dizaines/µm². Pour rappel, Jacques avait effectué ces mesures en cytométrie en flux. En utilisant des billes de calibration, il avait pu remonter à des valeurs de densité de streptavidine comprises entre 100 et 400 streptavidine/µm², ce qui est particulièrement proche de que j’ai pu établir.
Un point particulièrement frappant est la faible affinité de la streptavidine pour les biotines situées sur les gouttes. La réaction est loin d’être totale et a en fait un rendement assez faible. Connaissant la plupart des ordres de grandeur intervenant dans cette réaction, on est en mesure d’estimer le k_on de notre réaction d’adsorption des streptavidines sur la biotine. C’est ce que nous allons faire dans le paragraphe suivant.