fois nettement plus grand puisque le recouvrement de fluorescence d’une zone de 1.5µm se passait en 2 secondes environ. Dans ce cas, une estimation du coefficient de diffusion donne D~1.1µm²/s.
La zone de contact reste donc fluide mais diffuse plus vite. On peut attribuer ces différences à la proportion de biotine. En effet, les biotines sont portées par des phospholipides dont la température de transition gel/fluide est en dessus de la température ambiante. Ces phospholipides ont donc tendance à abaisser la fluidité des membranes.
Il est aussi possible que la densité en streptavidine soit plus basse dans la seconde expérience permettant aux streptavidines de mieux diffuser.
Le résultat intéressant reste la fluidité des zones de contact. Les espèces chimiques, streptavidine, biotine et liens peuvent donc diffuser dans tout le système. Ceci est positif car cette libre diffusion est une condition nécessaire pour qu’un équilibre chimique et mécanique soit possible.
III-2 :Mesures de déformation : comparaison entre déformation et recrutement de streptavidines.
Une fois la fluidité des zones de contact mise en évidence, nous nous sommes penchés sur un autre effet aisément observable. Selon les différentes situations d’adhésion, on peut observer une variation significative de la taille des zones de contact et de la densité de streptavidine dans le patch. Il semble, a priori, que plus la densité de streptavidine dans le patch est grande, plus la déformation de la goutte est importante. J’ai reporté différentes situations d’adhésion sur la figure suivante.
θ~23°
Cos θ~0.92
θ~18°
Cos θ~0.95
θ~8°
Cos θ~0.99
Energie d’adhésion/densité de
streptavidine croissantes
Figure 7 : Différentes situations d’adhésion. On peut constater une nette variation de l’énergie d’adhésion (reliée à l’angle de contact) selon les expériences.Ainsi, dans notre système expérimental, l’énergie d’adhésion semble reliée à la densité de streptavidines dans la zone de contact. Ces observations rappellent les prédictions théoriques des modèles de Bell et al. par exemple. L’énergie d’adhésion est dans les cas extrêmes (dilués ou denses) proportionnelle à la concentration en liens. Nous avons donc voulu aller plus loin et mieux caractériser l’évolution de la déformation de la goutte en fonction la densité de streptavidine dans la zone de contact
A partir de nos expériences, nous pouvons faire de bonnes mesures de cosθ (qui intervient dans l’équation d’Young) et de la densité de streptavidine dans le patch. Nous avons donc essayé de tracer l’évolution de cosθ avec la densité de liens. La figure 5 est un graphe caractéristique de cette mesure.
Sur ce graphe, chaque point du graphe représente donc un évènement adhésif (une gouttelette) pour laquelle je mesure l’angle de contact et la densité de streptavidine dans le patch. J’ai représenté les barres d’erreur sur un seul point pour ne pas encombrer la figure.
Cette série de mesure correspond à un échantillon, c'est-à-dire une bicouche supportée (~1000biotines/µm²) et un lot de gouttelettes fonctionnalisées (~40+/-10streptavidine/µm²). La dispersité sur les densités de streptavidine en surface des gouttes est ici un avantage puisqu’elle permet de au sein d’un échantillon d’observer des tendances. Il semble ici,, comme le prédisent les modèles formels que le cosinus de l’angle de contant diminue (avec la densité de streptavidine. On peut fitter ces données par une droite dont la pente vaut numériquement 10^-6µm². 0.990 0.985 0.980 0.975 co s t h et a 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 densité de streptavidine (#/µm²) Conditions expérimentales Biotine0.1% (~1000/µm²)
Streptavidine initiale sur les gouttes ~40+/-10/µm²
fit linéaire :
cos théta=1.001(+/-0.003)-10e-6(+/-2e-6)*d_strep_patch
Figure 8 : Graphe cos(θ) vs d_strep. Quand la densité de streptavidine augmente dans le patch, la deformation de la goutte (l’angle de contact) augmente aussi.
Comme nous l’avons vu, dans les deux cas limites formels, l’équation d’Young peut s’écrire :
(
1 cos)
E liens*[
]
γ − θ = .
Dans le régime entropique, E est l’énergie thermique kT, dans un régime dense et énergétique, E est l’énergie d’un lien.
Grâce à nos mesures, on peut estimer une énergie E à partir de la pente de la droite. En supposant que toutes les streptavidines sont liées et en prenant une valeur de tension de surface de 12mN/m, l’énergie E dans notre fit linéaire vaudrait E=28kT(+/-6kT).
Cette valeur est bien plus grande que l’énergie thermique et s’approche de l’anergie des liens biotine/streptavidine en volume. On est donc visiblement dans un régime où c’est l’énergie des liens qui permet de déformer la goutte.
Nous allons commenter l’écart type assez grand de notre série de mesures.
Ces expériences présentent une certaine variabilité liée à la sensibilité des effets de surface. Nous déposons par exemple nos bicouches sur près d’un cm² et je ne néglige aucune zone où l’adhésion peut avoir lieu. Sur les grandes surfaces explorées, il est possible que mes bicouches aient des défauts ou présentent de légères différences modifiant localement les
phénomènes d’adhésion spécifique. Par ailleurs, j’ai pu observer assez fréquemment sur mes gouttes l’apparition de patches
lumineux qui semblent être des agglomérats de streptavidine. Ces agglomérats diffusent en surface des gouttes et ont notamment tendance à venir se placer au niveau de la ligne de contact entre goutte et bicouche supportée, gênant ainsi le transport de la streptavidine et de la biotine entre la zone de contact et l’extérieur. Ceci cause une variabilité au sein d’une même expérience.
Il y a aussi un bruit lié à notre méthode de mesure et de traitement des images. D’une part une mauvaise focalisation au niveau de la zone de contact entraîne facilement des erreurs sur la mesure du rayon des patches adhésifs. Par ailleurs, lors de mon traîtement d’image, je repère mes objets en imposant un seuil de valeur fixe. Ceci peut fausser la mesure des tailles de aptches selon qu’ils sont plus ou moins denses en streptavidine. Or, une erreur de 1 pixel sur la mesure de la taille d’un patch peut entraîner une erreur, dans nos gammes de déformation de l’ordre de ∆cos (θ)=+/-0.005. Ceci peut expliquer les erreurs sur l’axe des ordonnées. Cette erreur apparaît dans la barre d’erreur du graphique de la figure 8.
Par ailleurs, nous faisons des mesures en microscopie de fluorescence et les effets de bleaching sont inévitables. Notre fluorophore est ici de l’alexa488. Le temps de photobleaching de l’Alexa 488 dans nos conditions d’illumination est de l’ordre de 30s. La décroissance de fluorescence due au photoblanchiment étant exponentielle et le temps de mise au point pouvant différer de près d’une seconde, il y a une erreur de l’ordre de 5-10% sur l’intensité de fluorescence mesurée dans le patch. Ceci peut expliquer le bruit de la mesure des densités dans le patch et sur la goutte.
Jusqu’à maintenant, nous avons observé et mené des mesures sur les patches adhésifs sans vraiment savoir si l’adhésion observée était bien due à la création de liens biotine/streptavidine. Avant d’aller plus loin, nous allons mesurer la part de non-spécifique dans nos situations d’adhésion.
III-3 : Mesure des effets non spécifiques :