Première population

2.3.1.1. Cadre d’étude

La présente étude a été réalisée par l’Institut Pasteur de Bangui (IPB), où une partie

des examens biologiques des patients a été réalisée dans le laboratoire d’analyses

médicales, et a mis en contribution :

– le « service d’hépato-gastro-entérologie » de l’hôpital de l’Amitié de

Bangui pour le recrutement et l’inclusion des patients

– le « laboratoire de virologie » du CHU de Nancy pour la recherche

sérologique des marqueurs du VHB, la mesure de la charge virale et la caractérisation

moléculaire par séquençage des souches du VHB (gène préS/S), l’analyse

phylogénétique des séquences complètes de 29 souches du VHB

– le « Département d’Immunologie » du Laboratoire National de Santé de

Luxembourg pour le génotypage et l’analyse phylogénétique des séquences complètes et/

ou partielles des souches et l’étude des souches «particulières».

2.3.1.2. Patients

Les échantillons ont été collectés, entre Février et Septembre 2004, de 112 hommes et

de 84 femmes admis avec des symptômes d'hépatite aiguë ou chronique, dans le service

de gastro-entérologie de l’Hôpital de l’Amitié de Bangui. Bangui, capitale de la RCA

étendue sur une superficie de 66 km

²

, est la ville la plus importante avec une population

estimée à 737694 habitants en 2003 (Bureau de Recensement Central Bangui, 2003).

La plupart des patients sont venus de l'intérieur même de la ville de Bangui sur un rayon

de 50 km (secteur où les mouvements de population sont les plus importants), et

quelques autres sont venus directement des provinces de l’Est et de l’Ouest du pays,

éloignées d’environ 500 km de la capitale.

Pour participer à l’étude, un consentement éclairé et signé a été demandé aux patients

ou à leur proche. Dès l’inclusion du patient dans l’étude, un dossier clinique standardisé a

été rempli par le médecin du service, comprenant l’identification du patient, les

caractéristiques sociodémographiques, les antécédents médicaux, et les signes cliniques

(ictère, vomissements, hépatomégalie, oedèmes des membres inférieurs) à l’admission.

Deux prélèvements sanguins ont été réalisés sur deux tubes secs de 5 mL, dont l’un a été

utilisé pour la recherche des marqueurs du VHB, pour le dosage des transaminases

(ALAT et ASAT), et le deuxième a été réservé pour les études moléculaires

complémentaires. Pour les études moléculaires, tous les sérums ont été conservés à -80°C

jusqu’à leur utilisation.

2.3.1.3. Sérologie

La recherche des marqueurs du VHB (Ag-HBs, anticorps HBs, Ig totaux

anti-HBc) a été réalisée sur l’automate Architect (Laboratoires Abbott, Rungis, France) qui

utilise la technique de dosage immunologique microparticulaire par chimioluminescence

(CMIA).

2.3.1.4. Détermination de la charge virale

L’ADN du VHB a été quantifié par la technique de PCR en temps réel selon la

méthode Taq Man avec la trousse prête à l’emploi «HBV PCR kit» (Laboratoire Abbott,

Rungis, France) sur l’ABI PRISM 7000 SDS (Applied Biosystems). L’HBV Master

contenait les réactifs et les enzymes nécessaires à l’amplification spécifique d’une

séquence hautement conservée de 134 pb du gène de la capside (core) du VHB,

représentant tous les génotypes de A à H. Une sonde spécifique doublement marquée par

un émetteur (le fluorochrome FAM) en 5’ et un extincteur (TAMRA) en 3’ a été ajoutée

au mélange. Ce double marquage rend impossible toute élongation à partir de la sonde.

Lorsque l’émetteur et l’extincteur sont à proximité, aucune fluorescence n’est mesurée.

Lors de l’amplification, la polymérase (par son activité exonucléasique 5’3’) digère la

sonde et le fluorochrome est alors libéré. Cette fluorescence, proportionnelle au nombre

29 (± 3) copies/mL ; avec les extrêmes variant de 29 à 2,10

¹⁰

copies/mL. Les échantillons

pour lesquels un résultat positif a été noté mais avec une charge virale inférieure à 29

copies/mL était considérée comme détectables mais pas quantifiables.

2.3.1.5. Extraction de l’ADN viral

L’extraction de l’ADN viral a été réalisée selon la méthode Qiagen (QIAamp® DNA

Blood Mini Kit, Qiagen, Courtabouef, France). Le sérum est lysé dans des conditions de

dénaturation par le tampon AL reconstitué avec de l’éthanol absolu en présence de la

protéinase K. Les lysats ont été ensuite déposés dans la colonne contenant un gel de

silice. Après centrifugation, la colonne a été lavée avec deux tampons (AW1 et AW2).

L’ADN a été ensuite élué dans un tampon approprié (AE) et conservé à –20°C pour la

réalisation des PCR.

Après comparaison des résultats obtenus avec la trousse QIAamp® DNA Blood Mini

Kit, et l’automate m1000

^TM

(Laboratoires Abbott) les rendements étaient comparables,

aussi la méthode d’extraction Qiagen, plus simple à mettre en oeuvre, rapide et moins

coûteuse, a été retenue.

2.3.1.6. Amplifications géniques et purification des amplicons

– Au laboratoire de virologie de Nancy

La séquence complète du gène préS/S a été amplifiée avec les amorces «externes»

2810 (sens) et 979 (antisens) publiées par Bowyer et ses collaborateurs (Bowyer et al.,

1997) pour générer un grand fragment de 1,4 kb (Tableau V). Ensuite, une série de PCR

nichées a été réalisée avec un jeu d’amorces «internes» définies par Odemuyiwa

(Odemuyiwa et al., 2001) pour amplifier la région 3’ du gène pré-S1, le gène pré-S2 et

Figure 22 : Schéma de la région PréS/S étudiée

En pratique, pour la première PCR, le mélange réactionnel était composé de tampon

PCR 1X, 10,0 pM de chaque amorce sens (2810) et antisens (979), 10,0 mM de chaque

dNTP, 1,8 mM de MgCl

₂

, 1 unité de Taq DNA polymérase, de l’eau distillée et 5 µL

d’ADN pour l’amplification du fragment de 1,4 kb; dans un volume final de 50 µL. Les

conditions d’amplification étaient les suivantes : 5 min de dénaturation à 95°C suivie de

30 cycles d’une min à 95°C, 30 secondes d’hybridation à 50°C, et 1 min d’élongation à

72°C et enfin un cycle d’élongation finale de 10 min à 72°C.

Pour la réalisation des PCR nichées, 5 µL des produits d’amplification de la première

PCR ont été repris dans un volume réactionnel final de 50,0 µL. Les produits de PCR ont

été préparés et amplifiés dans les mêmes conditions. Les amplicons ont été ensuite

séparés par électrophorèse en gel d’agarose et détectés aux UV grâce à l’incorporation du

BET (contenu dans le gel) entre les bases de l’ADN.

Deux méthodes de purification des produits de PCR ont été testées : la purification par

la trousse Wizard (Wizard® PCR Preps DNA Purification System, Promega) et la

purification par précipitation de l’ADN à l’éthanol, en présence d’acétate de sodium 3M

et de l’EDTA 125 mM préparés dans le laboratoire Central de Biochimie du CHU de

2810

PR

PRES-R

PF

PRES2-F

979

Pré-S1 Pré-S2 S

2810

PR

PRES-R

PF

PRES2-F

979

Pré-S1 Pré-S2 S

PR

PRES-R

PF

PRES2-F

979

Pré-S1 Pré-S2 S

PR

PRES-R

PF

PRES2-F

979

Pré-S1 Pré-S2 S

PR

PRES-R

PF

PRES2-F

979

Pré-S1 Pré-S2 S

PRES-R

PF

PRES2-F

979

Pré-S1 Pré-S2

PRES-R

PF

PRES2-F

979

Pré-S1 Pré-S2

PF

PRES2-F

979

Pré-S1 Pré-S2

PRES2-F

979

Pré-S1

PRES2-F

979

Pré-S1

PRES2-F

979

PRES2-F

979

979

PreS1 PreS2 S

Nancy. Les rendements étant nettement meilleurs avec la technique de précipitation

(moins coûteuse et rapide), elle a donc été retenue.

– Au laboratoire National de Santé au Luxembourg

Le génome complet des VHB a été séquencé avec les couples d’amorces définies par

Olinger et ses collaborateurs (Olinger et al., 2006). Très brièvement, les quatre ORF (S,

X, C, Pré-S) ont été amplifiés avec quatre couples d’amorces (Tableau V) à raison de

deux « rounds ou PCR » par couple (PCR nichée ou semi-nichée). Toutes les PCR ont

été réalisées dans un volume final de 25 µL avec : le tampon PCR 1X, 200 nM de

dNTPs, 200 nM de chaque amorce sens et antisens, du MgCl

₂

à des concentrations

variables, 1 unité de la Taq DNA polymérase et 5 µL d’échantillon d’ADN. Les

conditions d’amplification étaient les suivantes : 5 min de dénaturation à 95°C suivie de

40 cycles (pour les premières PCR ou « round 1 » et 30 cycles pour les PCR nichées ou

semi-nichées ou « round 2 ») de 20 secondes (s) à 95°C, 20 s d’hybridation à des

températures variables (0,3°C/s) et 90 s d’élongation à 72°C (Olinger et al., 2006). Les

produits de PCR ont été purifiés sur des mini-colonnes de chelex (Qiagen PCR kit,

Qiagen, France) et élués dans de l’eau distillée.

2.3.1.7. Séquençage

Après le dosage spectrophotométrique, 10 à 30 ng d’ADN purifié ont été utilisés dans

la réaction de PCR de séquençage basée sur la technique de terminaison aléatoire de

chaînes avec la trousse ABI PRISM® Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing,

Applied Biosystems. Ils ont été séquencés dans les deux directions en utilisant le même

jeu d’amorces utilisées pour les PCR nichées. Le milieu réactionnel contenait : 2,0 µL de

Ready Reaction Premix 2,5X ; 1,0 µL tampon sequencing 5X (BigDye Terminator

V1.1/V3.1) ; 3,2 pmol d’amorce, 10 à 30 ng de matrice et de l’eau bi-distillée. Ce

mélange a été soumis à 25 cycles d'amplification de 10 s à 96°C (dénaturation) , 5 s à

50°C (hybridation) et 4 min à 72°C (élongation) dans un thermocycleur (GeneAmp PCR

System 2400, Applied Biosystems). Les produits amplifiés ont été purifiés par

précipitation avec l’acétate de sodium 3,0 M ; EDTA 125,0 mM, pH = 5,6 et éthanol

95% (v/v), puis le culot d’ADN a été évaporé à l’aide d’une centrifugation à vide (Speed

VAC

^TM

). Les séquences nucléotidiques ont ensuite été déterminées avec le séquenceur

ABI PRISM® 3100 - Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

2.3.1.8. Clonage

Les échantillons qui présentaient plusieurs nucléotides mixtes ont été analysés

ultérieurement (dans le Département d’Immunologie au laboratoire National de Santé au

Luxembourg) par clonage des fragments PréC/C, PréS et S dans des vecteurs

plasmidiques pCR4-TOPO (Trousse TOPO TA Cloning, Invitrogen). L’intérêt de cette

trousse est de fournir un vecteur comprenant les séquences d’ADN du bactériophage

M13 introduites de part et d’autre site de ligation, permettant ainsi l’amplification et le

séquençage en entier des inserts en utilisant des « amorces universelles M13 »

commercialisées. De plus ce vecteur présente des T (thymine) aux extrémités 3’, ce qui

permet une ligation directe des produits de PCR en 5 min. Ces vecteurs ont ensuite été

utilisés pour la transformation d’E. coli rendues compétentes par électroporation. Ces

vecteurs possèdent un gène de résistance à l’ampicilline, pour sélectionner les bactéries

ayant incorporé le vecteur, et un segment de l’opéron lactose de E coli codant la β

-galactosidase, afin de sélectionner les clones bactériens contenant les vecteurs avec un

fragment d’ADN inséré. Les inserts ont ensuite été amplifiés en utilisant les amorces

universelles M13 sens et antisens et les amplicons de bonne taille ont été séquencés dans

les deux directions selon la technique du «Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing»

décrite au paragraphe 2.3.1.7 ci dessus.

2.3.1.9. Analyse des séquences

Les séquences nucléotidiques des génomes des VHB ont été numérotées par rapport à

la séquence complète du génome de la souche de référence HHVBBAS, numéro d’accès

GenBank = X75657. Les électrophorégrammes des séquences obtenues ont été analysées

avec le logiciel SeqScape version 2.5 (Applied Biosystems). Les séquences ont été

alignées et comparées avec le logiciel BioEdit version v7.0.5 (BioEdit Sequence

Alignement Editor) et son programme intégré CLUSTAL W. Les régions des séquences

présentant une ambiguïté ont été corrigées manuellement afin d’avoir des séquences

homologues devant permettre de reconstruire les relations évolutives entre les virus.

L’analyse phylogénique était basée sur le génome complet ainsi que les quatre cadres de

lecture chevauchants correspondant aux gènes préS1/préS2, S, préC/C et X. Soixante dix

huit (78) souches de référence représentant les huit génotypes connus, ainsi que des

souches de référence du génotype A1 d’Afrique de l’Ouest ; E, D3 et D4 de l’Afrique du

Sud et de l’Afrique de l’Est (Hannoun et al., 2005; Mulders et al., 2004; Sugauchi et

al., 2003) ont été incluses.

Les arbres phylogénétiques ont été construits avec le logiciel MEGA version 3.0, en

utilisant la méthode du plus proche voisin ou « Neighbour-joining » et le modèle de

correction de Kimura à 2 paramètres (K2P) pour le calcul des distances. Les valeurs

statistiques placées sur les nœuds sont calculées par le bootstrap (méthode statistique qui

estime la robustesse de l’arbre et des branches), en comparant 1000 fois la séquence de

chaque souche à celles des autres. Si un arbre est robuste, c'est-à-dire fortement soutenu

par les données, alors sa variabilité sera faible. Par contre si un arbre est peu robuste il

aura une grande variabilité. Ainsi, une valeur de bootstrap de 100% est équivalente à un

nœud vrai ou robuste. Les phylogrammes ont été visualisés grâce au programme

«TREEVIEW».

Les recombinaisons ont été identifiées en construisant des arbres phylogénétiques

séparés des différents gènes ou des segments de gène. Il est admis qu’un évènement de

recombinaison a eu lieu chaque fois qu’un fragment génomique se regroupe avec des

génotypes différents. Ces séquences ont aussi été analysées par la méthode de

comparaison des points (ou de régions) de similarité (Similarity plots ou SimPlot). Le

Simplot est une méthode qui permet une visualisation graphique de la comparaison

globale de deux séquences. Les deux séquences à comparer sont placées le long des axes

d’un graphique. L’intersection de chaque colonne et de chaque ligne est marquée d’un

point si la lettre (ou la région) est la même dans les deux séquences (points de

similitudes, région de similarité). La similarité entre séquences se traduit par une suite de

points alignés : la diagonale en cas d’identité parfaite, un décalage par rapport à la

diagonale indique une insertion (ou une délétion) et une inversion franche de

l’orientation traduit une inversion d’une région d’ADN.

Dans le document Aspects cliniques et épidémiologiques des infections à virus de l'hépatite B en République Centrafricaine (Page 107-115)