présente la dégradation du 3-hydroxybenzoate par deux bactéries : P

acidovorans et P. testosteroni qui possèdent toutes deux la gentisate 1,2- dioxygenase. P. testosteroni peut également dégrader le 3-hydroxybenzoate grâce à une autre enzyme qu’elle possède, la protocatechuate 4,5-dioxygenase.

Figure 44 Voies de dégradation du 3-hydroxybenzoate par P. acidovorans et P. testosteroni et enzymes mises en jeu (Harpel et Lipscomb, 1990)

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IV IMMOBILISATION DES CELLULES

IV.1 Définition

Les procédés d’immobilisation des microorganismes sont des techniques biotechnologiques de plus en plus développées notamment en vue du traitement des eaux ou pour l’industrie car les microorganismes sont ainsi plus faciles à manipuler. Ces techniques d’immobilisation miment la nature où les bactéries sont rarement en suspension et forment au contraire des agrégats, des flocs, des biofilms qui sont des structures qui les protègent.

IV.2 Généralités

La technique des cellules immobilisées est une technique ancienne, pour illustration, elle est utilisée traditionnellement par les allemands dans la fabrication du vinaigre où des bactéries acétiques sont immobilisées sur des copeaux de hêtre (Figure 45).

Figure 45 Fabrication du vinaigre par immobilisation des bactéries acétiques sur

copeaux de bois

L’immobilisation d’une culture active de bactéries peut par exemple apporter des avantages dans les processus de fermentation ce qui lui confère notamment un intérêt pour l’industrie agroalimentaire (production de yaourts, fromages, kéfir…). Une autre application de l’immobilisation des microorganismes est la bioremédiation.

De très nombreuses études pour la mise en place de procédés industriels ont été menées ces dernières années sur les systèmes immobilisés synthétiques ou naturels et ont mis en évidence les avantages et les inconvénients de cette technique (Tableau 10).

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Avantages Inconvénients

Haute densité cellulaire d’où bioconversion plus rapide

Possibilité de détachement des cellules du support entraînant une contamination du

milieu Protection des cellules : augmentation

de leur stabilité biologique et physique

Stabilité mécanique et chimique de certains supports parfois insuffisante (décomposition

par le produit, dissolution)

Facilité de récupération/de séparation Possibilité de destruction du support par les cellules qui prolifèrent induisant la libération

de ces dernières Stimulation de la production et de la

sécrétion des métabolites

Bioconversion parfois ralentie du fait d’une limitation de la diffusion

Stabilité plasmidique Coût élevé à grande échelle

Modification possible du métabolisme Modification possible du métabolisme

Résistance à la contamination Réutilisation possible du support et des

cellules immobilisées Travail en continu

Tableau 10 Avantages et inconvénients des techniques d'immobilisation des cellules (Junter et Jouenne, 2004)

IV.3 Les techniques d’immobilisation

L’immobilisation des cellules peut s’effectuer selon diverses méthodes : l’adsorption ou l’attachement à un support préformé, l’inclusion dans des matrices poreuses, la rétention derrière des membranes et la floculation (Figure 46). Il y a également la technique de cross-linking qui consiste à attacher les cellules entre elles par des liaisons chimiques en utilisant des réactifs de type glutaraldéhyde, mais cela reste une méthode peu utilisée.

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Figure 46 Classification des techniques d’immobilisation adaptée de Willaert et Baron 1996

IV.3.1 Adhésion à un support

Cette technique d’immobilisation (Figure 47) est basée sur la facilité qu’ont les cellules à coloniser une surface solide et à s’y développer. Dans un premier temps, grâce à un phénomène de transport actif ou passif, la bactérie entre en contact avec une surface. La deuxième étape consiste en une adhésion bactérienne d’abord réversible par le biais notamment de forces électrostatiques et de Van der Waals puis de manière irréversible grâce à des liaisons covalentes avec notamment la synthèse d'exopolysaccharides. Les phénomènes d’adhésion sont régulés, d’une part, par la présence d’organelles de surface bactérienne (pili, fimbriae, curli) et d’adhésines, d’autre part, par les conditions physico-chimiques de la surface d’adhésion et les conditions physico-chimiques environnementales (pH, température,…). La troisième étape correspond à l’arrivée d’autres bactéries aboutissant à un regroupement bactérien qui constitue des micro-colonies permettant la cohésion du biofilm. La quatrième étape est une étape de maturation et de détachement. Cette phase correspond à l’organisation du biofilm dont la structure est complexe : micro-colonies de bactéries reliées entre elles par des structures filamenteuses constituant un réseau au sein duquel se développent des canaux permettant une circulation et des échanges de nutriments et d’oxygène. A la phase de maturité du biofilm, des bactéries peuvent s’en détacher pour retourner à l’état planctonique en vue de reformer un biofilm à distance caractérisant ainsi l’état dynamique du biofilm. Cette structure complexe du biofilm lui permet de résister aux agressions physico-chimiques externes (Junter et Jouenne, 2004). La Figure 48 montre le mécanisme de formation d’un biofilm.

Adhésion Biofilms

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Figure 47 Immobilisation à la surface d’un support : 3 méthodes (Kourkoutas et al., 2004)

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Nous pouvons citer quelques exemples de supports poreux solides utilisés fréquemment : le verre, la céramique, l’acier inoxydable, le caoutchouc de silicone. Pour des supports non poreux, l’immobilisation des cellules se fait grâce à la formation naturelle d’un biofilm ce qui signifie que l’utilisation de ce type de support n’est pas propice à tous les microorganismes. Groboillot et al. (1994) ont par ailleurs montré que le biofilm peut se séparer du support lorsque les interactions sont faibles.

La diffusion du substrat et par conséquent sa biodisponibilité posent moins de difficultés dans le cas de l’immobilisation par adhésion sur un support que lors d’une immobilisation par inclusion dans des matrices poreuses. Autre avantage de cette méthode, les supports utilisés sont plus résistants aux forces de cisaillement et de compression produites par l’agitation dans les bioréacteurs et permettent généralement une stérilisation par la vapeur. Les deux principaux aspects négatifs de cette méthode par rapport à l’inclusion dans des matrices poreuses sont la moindre densité cellulaire et le problème du détachement de cellules.

IV.3.2 Inclusion dans des matrices poreuses

Le procédé d’inclusion dans une matrice poreuse (Figure 49) est le procédé d’immobilisation le plus répandu, il est surtout utilisé dans l’industrie agroalimentaire.

Figure 49 Inclusion dans une matrice poreuse (Kourkoutas et al., 2004)