Inclusion des cellules dans un gel

Les cellules sont piégées par gélification d’une matrice polymère poreuse permettant le transport des substrats et des produits, constituée de gels de polysaccharides, de polymères naturels (polyacrilamide) ou de protéines. Lorsque l’application est pour l’alimentaire, ces gels ne doivent présenter aucune

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toxicité. Les plus couramment employés sont le κ-carraghénane et l’alginate pour leur faible coût, leur biocompatibilité et leurs propriétés mécaniques, mais nous retrouvons également la gomme de gellan, l’agarose, la gélatine et le chitosan. Les billes de gel peuvent être obtenues selon divers procédés :

par extrusion

par émulsion suivie d’une étape de solidification (refroidissement ou ajout d’un gélifiant)

Dans le cas de la méthode par extrusion, une solution liquide de polymère mélangée aux microorganismes est extrudée par une seringue engendrant des gouttes sphériques qui tombent dans une solution de durcissement. Dans le cas de la méthode par émulsion, la solution aqueuse de polymère mélangé aux microorganismes est dispersée dans une phase organique donnant une émulsion eau dans huile. Les gouttes dispersées sont alors durcies soit par abaissement de la température soit par ajout d’un gélifiant. La technique de l’émulsion permet d’obtenir des billes de plus petit diamètre que par extrusion et est plus propice à la production industrielle à grande échelle. Ces procédés ont été détaillés parGroboillot et al. (1994).

IV.3.2.2 Inclusion des cellules dans un support préformé

La matrice d’immobilisation est ajoutée en début de fermentation. Les cellules diffusent dans les espaces libres du support puis elles s’y développent. Afin d’obtenir des densités de biomasse élevées, des supports de haute porosité sont préférables car ils permettent aux microorganismes d’accéder aux surfaces intérieures et extérieures. Le diamètre idéal des pores est celui pour lequel les pores sont assez grands pour permettre la diffusion et la croissance des microorganismes dans la matrice mais aussi suffisamment petits pour empêcher la libération des cellules en croissance. De fortes concentrations de cellules immobilisées de Lactobacillus rhamnosus ont été obtenues par ce moyen lors de la production d’exopolysaccharides (Bergmaier et al., 2003).

IV.3.3 Cellules immobilisées derrière une barrière

Le maintien des cellules derrière une barrière (Figure 50) peut se faire soit par l’utilisation de filtres avec une membrane microporeuse, soit par le piégeage des cellules dans une microcapsule, soit par immobilisation des cellules sur une surface d’interaction entre deux liquides non miscibles (Kourkoutas et al., 2004).

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Figure 50 Cellules immobilisées derrière une barrière (Kourkoutas et al., 2004)

L’avantage de ces systèmes d’immobilisation est la quantité de biomasse qu’ils permettent de mettre en oeuvre, quantité 7 à 10 fois plus élevée qu’en batch classique (Prigent et al., 1988). En revanche, les plus gros inconvénients présentés par l’immobilisation des cellules entre des membranes microporeuses sont la limitation de transfert de masse (Lebeau et al., 1998) et la possibilité d’encrassement des membranes due à la croissance des cellules.

Cette technique d’immobilisation est limitée selon un rapport du Cemagref émis en 2004 : ses applications concernent principalement le traitement d’effluents industriels et domestiques pour des villes ne dépassant pas 200000 habitants. En effet, elle permet de traiter seulement de faibles quantités d’effluents et demande une consommation d’énergie importante pour éviter le colmatage des membranes (aération par grosses bulles). Il est par ailleurs essentiel de nettoyer régulièrement le système avec de l’eau de Javel pour lutter contre l’encrassement des membranes car ces membranes ont un coût élevé pour une durée de vie limitée à seulement 7 ans environ. L’utilisation de ces réacteurs est encore limitée en France mais la technique s’avère prometteuse car le coût des membranes diminue.

IV.3.4 Floculation

Le procédé de floculation (Figure 51) est utilisé dans les stations d’épuration. Lorsque de l’air est injecté dans de l’eau sale, il se développe

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rapidement une communauté bactérienne qui se nourrit de composés organiques. Ces microorganismes croissent, s’agglomèrent et finissent par former des « flocs bactériens » qui sédimentent dès que l’aération est arrêtée. La floculation peut effectivement être considérée comme une technique d’immobilisation puisque la taille importante des aggrégats formés permet une utilisation potentielle dans des réacteurs. Cette faculté à former des aggrégats est observée chez les moisissures, les champignons et les cellules végétales. Des agents de floculation artificiels peuvent également être utilisés pour améliorer l’aggrégation dans des cultures cellulaires qui ne floculent pas naturellement.

Figure 51 Cellules immobilisées par floculation (Kourkoutas et al., 2004)

IV.4 Immobilisation des cellules dans un gel d’alginate

Notre choix de technique d’immobilisation s’est porté sur l’encapsulation des bactéries dans des matrices poreuses et plus particulièrement dans un gel polymérique d’alginate. C’est une technique relativement facile à mettre en place et peu coûteuse. La littérature montre par ailleurs qu’un certain nombre d’études ont déjà été réalisées avec ce procédé et donne des résultats prometteurs.

IV.4.1 L’alginate

IV.4.1.1 Généralités

L’alginate ou les alginates sont des polysaccharides linéaires contenus dans les laminaires, genre d’algues brunes. Ces composés forment des gels durs et thermostables. Ils sont largement employés comme additifs par l’industrie agroalimentaire dans le cadre, par exemple, de la reconstruction des aliments comme

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les cordons bleus, le jambon, le poisson pané et donnent une texture onctueuse aux crèmes glacées et aux sauces. Leurs propriétés diverses d’émulsifiants, de gélifiants, d’épaississants et de stabilisants en font des composés également présents dans l’industrie des cosmétiques, des peintures et des encres d’imprimerie. Leurs qualités hypoallergéniques sont intéressantes pour le domaine médical où ils trouvent diverses applications. Ils sont parfois employés pour l’encapsulation de principes actifs ou de substances biologiques fragiles (enzymes, microorganismes). Les dentistes les utilisent pour prendre des empreintes dentaires et ils entrent dans la composition de certains pansements de cicatrisation (ALGISITE M^®, ALGOSTERIL^®).

D’un point de vue chimique, l’alginate est un copolymère constitué de deux acides uroniques : l’acide mannuronique et l’acide guluronique qui peuvent être associés dans différentes séquences (Figure 52). Ces deux acides possèdent des propriétés très intéressantes qui confèrent aux algues, dont ils composent le squelette, à la fois leur force et leur flexibilité. L’acide D-mannuronique (M) a la propriété d’être mou et souple contrairement à l’acide L-guluronique (G) qui a un caractère ferme.

Figure 52 Copolymère d’alginate constitué de 2 unités d’acide guluronique et de 2 unités d’acide mannuronique

Les polymères isolés de différentes algues ou bien de différentes parties d’une même algue peuvent présenter différentes structures constituées du même monomère (M-M-M-M ou G-G-G-G-) ou de différents assemblages des deux monomères -M-M-G-M-G- par exemple. Il apparaît donc évident que le rapport entre le nombre d’unités G et le nombre d’unités M confère des propriétés différentes aux

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alginates. Les acides mannuroniques et guluroniques peuvent également être liés par des ions divalents tels que Ca²⁺.

L’alginate peut être soluble ou non selon la nature du sel associé. Ainsi, les sels de sodium ou d’autres métaux alcalins sont solubles dans l’eau alors que les sels de cations polyvalents ne le sont pas, à l’exception des sels de magnésium. C’est donc d’après ces propriétés qu’ont été développés les procédés de gélification.