1.2. La préparation des liposomes

Deux méthodes sont présentées dans cette section : le procédé SAS et la méthode de Bangham. Ces méthodes sont divisées en deux étapes : une étape de division des phospholipides et une étape d’hydratation des phospholipides divisés ; l’étape d’hydratation est commune aux deux méthodes. Dans les deux cas, la lécithine traitée (phospholipides divisés) doit être hydratée très rapidement sous peine de détérioration des phospholipides divisés au contact de l’air [4].

Le procédé SAS est un procédé utilisant du CO2 supercritique pour microniser la lécithine. Le procédé SAS consiste à disperser une phase organique contenant le soluté (lécithine) à précipiter dans un continuum de fluide supercritique (dans notre cas, le CO2

supercritique). Les deux phases sont introduites en parallèle. Le CO2 supercritique est solubilisé dans la phase liquide tandis que le solvant diffuse dans la phase supercritique. Ces transferts conduisent à une forte diminution de la solubilité du soluté dans le mélange CO₂/solvant et donc à la sursaturation en soluté, provoquant la précipitation de ce dernier.

La méthode de Bangham est une méthode conventionnelle qui consiste à solubiliser la lécithine brute dans un solvant organique et dans un deuxième temps, à évaporer le solvant sous agitation pour former un film phospholipidique dans le fond d’un ballon.

Par souci de comparaison, le procédé SAS et la méthode de Bangham ont été conduites dans les mêmes conditions, c’est-à-dire avec les mêmes phospholipides (lécithine de soja) et le même solvant organique (éthanol).

Cette section se divise en deux parties : tout d’abord, la micronisation de la lécithine et ensuite, la phase d’hydratation.

III-1.2.1. Production de phospholipides divisés

III-1.2.1.1. Le procédé SAS

Le procédé SAS consiste à injecter une solution organique (éthanol absolu) contenant le soluté solubilisé (lécithine de soja et cholestérol) au travers d’un capillaire dans un continuum de CO₂ supercritique. La solubilisation simultanée du fluide supercritique dans la phase liquide et la diffusion du solvant organique dans la phase supercritique conduit à la sursaturation du soluté dans la phase liquide et sa précipitation.

L’autoclave de précipitation est préalablement rempli de CO₂ pour atteindre la pression de travail ; puis de l’éthanol absolu pur est injecté jusqu’à l’obtention du rapport molaire CO2/solvant souhaité. Ensuite, un débit de CO2 est établi et le rapport molaire CO2/solvant est maintenu. C’est dans ces conditions que la solution organique est injectée dans l’autoclave conduisant à la micronisation de la lécithine de soja. Une fois que la quantité souhaitée de solution organique a été introduite dans l’autoclave, une étape de lavage est réalisée de façon à éliminer les traces de solvant organique de l’autoclave. La phase de lavage est réalisée avec du CO2 pur dans les mêmes conditions opératoires que lors de la phase d’injection. Etant donné que le CO2 pur est plus léger que le mélange CO2+éthanol absolu, l’autoclave se comporte durant cette étape comme un autoclave piston [146, 147]. Le lavage est effectué durant un temps égal à deux fois le temps nécessaire pour renouveler le contenu de l’autoclave.

Le montage expérimental pour le procédé SAS est présenté sur la Figure III-1. La solution organique est injectée grâce à une pompe volumétrique (Gilson, modèle 307) dans l’autoclave (autoclave en acier Fedegari de 650 cm³) au moyen d’un capillaire d’injection de diamètre interne 127 µm (Chrompack). Le CO2 gazeux est transformé en CO2 liquide grâce à un groupe froid pour être pompé par une pompe volumétrique haute pression (Dosapro Milton Roy, Pompe à membrane). En sortie de pompe, le CO₂ est chauffé grâce à un groupe chaud.

Le fond de l’autoclave est équipé d’un fritté métallique permettant de ne pas entraîner les particules solides. Un piège à solvant froid (séparateur) permet de récupérer le solvant et le

Figure III-1 - Schéma du procédé SAS

1 Groupe froid 7 Soupape de sécurité

2 Pompe volumétrique 8 Déverseur

3 Groupe chaud 9 Séparateur

4 Débitmètre 10 Vanne de soutirage

5 Capteur de température 6 Manomètre

Le procédé SAS a été appliqué dans des conditions de pressions allant de 9 à 13 MPa, des concentrations en lécithine comprises entre 15 et 25 % massique et des rapports molaires CO₂/solvant allant de 50 à 100. Pour chaque expérience, la température dans l’autoclave est de 308 K, le débit d’injection de solution de 22,8 mL.h^-1 et deux grammes de lécithine ont été micronisés dans l’autoclave. Ces conditions expérimentales ont été définies suite à l’étude du diagramme de phase du système CO₂/lécithine/éthanol réalisée par Magnan et al. [4]. La Figure III-2 présente la courbe de transition entre le domaine biphasique (liquide-solide ou supercritique-solide) et le domaine triphasique (liquide-vapeur-solide) du système CO₂/lécithine/éthanol sous pression. Pour réaliser nos expériences, nous avons choisi des conditions de température et de pression telles que le système se situe dans le domaine biphasique. En effet, la lécithine à une forte affinité pour l’éthanol et la micronisation ne se fait pas si l’on se place dans des conditions pour lesquelles la phase continue fluide est liquide-vapeur.

Figure III-2 - Diagramme de phase du système : CO₂ (90% massique)/lécithine de soja S75 (2%

massique)/éthanol

III-1.2.1.2. La méthode de Bangham

Le procédé de Bangham comprend également une étape de comminution de la lécithine de soja et une phase d’hydratation conduisant à la formation des liposomes. La phase d’hydratation, commune aux deux méthodes, sera détaillée dans le paragraphe suivant. Pour ce qui concerne le traitement de la lécithine de soja, la méthode de Bangham consiste à évaporer le solvant organique (323 K) dans lequel la lécithine de soja a été solubilisée grâce à un évaporateur rotatif muni d’une pompe à vide (Heidolph Laborota 4000eco). Après un certain laps de temps, un film homogène de phospholipides se forme dans le fond du ballon.

Dans le but de comparer le procédé SAS avec la méthode de Bangham, pour chaque expérience réalisée avec la méthode de Bangham, 2 grammes de lécithine ont été traités.

III-1.2.2. Hydratation et encapsulation

Les particules de phospholipides micronisées obtenues par le procédé SAS et le film phospholipidique résultant de la méthode de Bangham sont hydratés de la même façon pour aboutir à la formation de liposomes encapsulant un marqueur fluorescent : la calcéine. Cette hydratation est réalisée par ajout d’une solution aqueuse de calcéine (0,062 g.mL^-1) dans l’autoclave ramené dans les conditions ambiantes pour le procédé SAS ou dans le ballon d’évaporation pour la méthode de Bangham. La température est maintenue égale à la température ambiante (soit environ 298 K) lors de cette phase d’hydratation. Le mélange est ensuite agité avec un agitateur à fort cisaillement (Ika Labortechnik, Ultraturax T25) à 11 000 tr.min^-1 pendant 10 minutes. D’après Oku et al. [75], le volume de solution aqueuse de calcéine est calculé en sachant que le rapport massique calcéine/lécithine doit être égal à 0,008 (rapport massique lécithine/eau égal à 0,013). Les suspensions liposomiales ainsi

Température / K Pression / MPa

Biphasique

Triphasique