Préparation du gel d’agarose

Le  Tampon  TAE  (solution  tampon  Tris  Acétate  400  mM,  EDTA  10mM,  pH  8,3)  1X   a   été  préparé  à  partir  du  TAE  10X    en  ajoutant  100ml  de  TAE10X  à  900ml  H2Od.  

Pour  la  préparation  du  gel  d’agarose  1%,  1g  d’agarose  a  été  dissout  dans  100ml  de   TAE  1X,  puis  cuit  à  la  ‹…”‘‘†‡’‡†ƒ–ʹͶ͸ͲǤ’”°•ƒ˜‘‹”ƒŒ‘—–±ͷɊŽ†‡›„” green  I  (Invitrogen)  au  gel,  celui-­‐‑ci  est  coulé  délicatement  dans  la  cuve  à  électrophorèse   (BIORAD).    

Les  échantillons  ont  été  déposés  sur  le  gel  après  avoir  vérifié  que  le  tampon  de   migration,  préalablement  versé  dans  la  cuve,  couvrait  de  quelques  millimètres  le  gel.   ͵ɊŽ†‡„Ž‡—†‡  migration  

                                                                                                             Par  échantillon/puits   ͺɊŽ†ǯ…  amplifié  

3  ɊŽ†—Žƒ††‡”†ans  le  puits  n°1  

Electrophorèse  et  révélation  sous  lumière  noire  (appareil  Safe  Imager   trans-­‐‑   illuminator  Invitrogen,  émission  470  nm).  Electrophorèse  à  100V  pour  45minutes.  

Figure  20  :  A  gauche  une  Cuve  d’électrophorèse  couplée  à  un  générateur  (CEA)  à  droite   course   électrophorétique  des  acides  nucléiques  du  VHE  sur  gel  d’agarose  à  1%  

2.3.5.  Screening  des  produits  de  Nested  suspects  par  PCR  sur  colonies   2.3.5.1.  Ligation  du  gène  dans  le  vecteur  pJET1.2  (50  ‰ȀɊŽȌ  

͵ɊŽ†‡’”‘†—‹–•†‡‘–±–±±Žƒ‰±•ƒ˜‡…ͳͲɊŽ†‡±ƒ…–‹‘—ˆˆ‡”ȋʹȌǡ͵ɊŽ   d’H2O   nucléase-­‐‑ˆ”‡‡ ‡– ͳ ɊŽ †‡  Ž—–‹‰ œ›‡ǡ ’—‹• ‹…—„‡”  ͹Ͳι  ’‡†ƒ– ͷ min  dans  un  bain  marie  avant  d’être  placé  sur  la  glace  pendant  5  min.  

Chaque   produit   de   PCR,   a   été   ligaturé   dans   1   ɊŽ   de   pJET1.2/Blunt   Cloning   Vector   ȋͷͲ‰ȀɊŽȌƒ˜‡…ͳɊŽͶ‹‰ƒ•‡Ǥǣ…‡’Žƒ•‹†‡’‘••°†‡†‡—š‰°‡•ǣ— gène  de  résistance  à  l’ampicilline,  et  un  gène  suicide.  Le  gène  tueur  situé  au  niveau  du   site  d’insertion,  est  activé  lorsque  le  plasmide  se  referme  sans  contenir  le  gène  d’intérêt.  

Par  suite  les  tubes  ont  été  incubés  sur  la  paillasse  pendant  20  min,  puis  replacés   sur  la  glace.  

2.3.5.2.  ”ƒ•ˆ‘”ƒ–‹‘†‡•„ƒ…–±”‹‡•ȋͷȽȌ  

ͳͲɊŽ†‡  solution  bactérienne  ‘–±–±ƒŒ‘—–±•͵ɊŽ†‡’”‘†—‹–†‡Ž‹‰ƒ–‹‘ǡ’—‹•‹• sur  la  glace  pendant  30  min.  Ensuite  un  choc  thermique  a  été  provoqué  (permettre  aux  

plasmides   de   rentrer   dans   les   bactéries)   en   mettant   les   tubes   dans   un   bain   marie   à   37°C  pendant  15  secs.  

͵ͲͲ ɊŽ †‡   LB   (Lysogeny   Broth)   ou   de   SOC   (Super   Optimal   broth   with   Catabolite   repression)  (milieux  nutritifs)  ont  ensuite  été  ajoutés  au  mélange  (bactéries+  produits   ligation)  sous  PSM,  puis  incubé  dans  un  bain  marie  à  37°C  pendant  30  min.  

L’étalement   sur   boite   de   Pétri   contanant   le   milieu   LB   +   Antibiotique   +     gélose   (ampicilline   ou   kanamycine)   a   été   effectué   sous   PSM,   puis   les   boites   de   Pétri   ont   été   incubées   à   37°C   pendant   24   h.   NB   :   Après   24h,   les   boites   ont   été   stockées   temporairement  à  4°C.  

2.3.5.3.  Repiquage  des  colonies  (toutes  ces  opérations  sont  à  réaliser   sous  PSM  

Après   24   h   d’incubation   à   37°   C,   les   colonies  intéressantes   ont   été   repiquées  sur   nouvelles   boites   de   Pétri   contenant   le   milieu   LB   +   Antibiotique   (ampicilline   ou   kanamycine).   Avant   de   repiquer   les   colonies   intéressantes,   des   lignes   numérotées   correspondant  aux  clones  qui  seront  déposés  (n°  des  individus  de  PCR)  ont  été  tracées.    

Pour   chaque   boite   préalablement   mise   en   culture,   un   cure-­‐‑dent   stérile   ou   une   pointe  de  micropipette  a  été  utilisé  pour  prélever  une  colonie  intéressante,  ensuite   un   ensemencement  par  strie  a  été  effectué  (tracer  une  ligne  vers  le  haut)  dans  la  colonne   correspondante  de  la  boite  de  Pétri,  puis  la  pointe  a  été  placée  dans  un  puits  de  la  plaque   ou  barrette  PCR  contenant  le  mix  PCR,  préparé  et  distribué  au  Préalable  (25  ɊŽ  de  mix).  

La   pointe   a   ensuite   été   touillée   plusieurs   fois   dans   le   mix   de   la   plaque   PCR,   puis   jetée  dans  la  poubelle  "déchets  solides".  

Par   suite   les   boites   de   Pétri   initiales   ont   été   scellées   avec   du   film   alimentaire   et   stockées  en  chambre  froide.  Quant  aux  nouvelles  boites  de  Pétri  où  les  colonies  ont  été   repiquées,  elles  ont  été  incubées  à  37°C  pendant  24  heures  en  surveillant  la  croissance   des  colonies.  La  PCR  a  été  réalisée  immédiatement.  

          50  

2.3.5.4.  PCR  sur  les  clones  

Réaliser  une  PCR  avec  les  amorces  universelles  ou  spécifiques    

Mix  PCR     [C]  initiale     [C]  finale     ˆȋʹͷɊŽȌȀ–—„‡  

PCR  Buffer  ou  coral  load  Buffer   10  X   1  X   2,5  

Primer  3158R   100  pm   10  pm   0,5    

Primer  3159F   100  pm   10  pm   0,5    

dNTPs     100  mM     ͳͲɊ   0,5  

Qsol   x   x   5    

Taq  platinum   5U/  ɊŽ   5U/  ɊŽ   0,125    

H2O  qsp         15,875    

NB  :  les  dNTPs  et  Primers  étant  concentré  10x,  ils  ont  été  dilués  au  10ème  (1x)    

Cycles  PCR  

Etapes   To   Temps   Cycles  

Denaturation   94°C   5  min   1   Denaturation   94°C   30  sec     30   Hybridation   52°C   30  sec   Elongation   72°C   40  sec   Elongation   72°C   7  min   1   Fin   20°C   infini      

2.3.5.5.  Vérification  sur  gel  d'agarose  de  la  taille  du  fragment  cloné  

Suivant   la   taille   du   fragment   cloné   et   la   qualité   des   amorces   spécifiques,   il   est   possible  d'envisager  un  séquençage  à  ce  stade.  

2.3.5.6.  Sélection  des  clones  (toutes  ces  opérations  ont  été  réalisées   sous  PSM)  

3  ml  de  LB  a  été  distribué  dans  des  tubes  de  culture  de  15  ml  sous  PSM).  

Sur   de   nouvelles   boites   de   Pétri   contenant   le   milieu   LB   +   Antibiotique   (ampicilline  ou   kanamycine),  des  lignes  numérotées  correspondant  aux  colonies  de  bactéries  de  la   série   ayant   permis   d'obtenir   le   bon   fragment   lors   de   la   PCR,   ont   été   tracées,   puis   une   emprunte  de  l’ancienne  boite  de  Pétri  contenant  nos  colonies  positives,  a  été  effectuée   dans  la  nouvelle  boite  à  pétri  à  l’aide  de  pointes  ou  cure-­‐‑dents  stériles  qui  ont  ensuite  

été   utilisés   pour   ensemencer   le   tube   de   culture   contenant   3   ml   de   LB.                           Les   tubes   de  culture  ont  ensuite  incubés  à  37°C  pendant  24h.  

2.3.5.7.  Extraction  du  plasmide  (toutes  ces  opérations  ont  été  réalisées   sous  PSM)      

Dans   un   micro-­‐‑tube,   1-­‐‑5   ml   de   la   culture   bactérienne   ont   été   prélevés   et   centrifugés  à  14,000   x   g   pendant   30   secs   (formation   d’un   dépôt   bactérien   au   fond   du   tube).   Après  avoir   jeté   le   surnageant   et   enlevé   autant   de   liquide   que   possible,   250   ɊŽ   de   tampon   A1   ont   été   ajoutés   au   culot   cellulaire,   puis   vortex   ou   pipetés   de   haut   en   bas,   afin   de   le   remettre   complètement   en   suspension.   NB   :   l’EDTA   fragilise   la   membrane   bactérienne.  La  RNase  lyse  les  ARN.  

ʹͷͲ ɊŽ †‡ –ƒ’‘ ʹ ‘– ±–± ƒŒ‘—–±•  ‘–”‡ ±Žƒ‰‡ǡ ’—‹• Š‘‘‰±±‹•± ‡ inversant   le   tube   6   -­‐‑   8   fois.   La   suspension   cellulaire   a   été   incubée   à   température   ambiante  pendant   5  minutes   maximum,   afin   qu’elle   s’éclaircisse   et   devient   visqueuse   (Le   SDS   est   un   détergent   qui   dissous   et   dégrade   les   composants   lipidiques   de   la   membrane  bactérienne,  libérant  ADN  et  protéines  dans  la  solution).  

͵ͲͲ ɊŽ †‡ –ƒ’‘ ͵ ‘– ±–± ‡•—‹–‡ ƒŒ‘—–±•  Žƒ •—•’‡•‹‘ cellulaire,   puis   mélangés  en  inversant   le   Tube   6   -­‐‑   8   fois,   et   centrifugés   pendant   5   min   à   14   000   g   à   température  ambiante.  NB  :  cette  étape  a  été  répété  dans  le  cas  où  le  surnageant  n’était   pas  clair.  L’acétate  de  sodium  précipite  protéines  et  ADN  chromosomique.  Ce  précipité   et   les   débris   cellulaires   sont   séparés   par   centrifugation   du   surnageant   qui   contient,   entre  autres,  l’ADN  plasmidique.  

L’ADN   plasmidique   a   été   filtré   sur   une   colonne   de   silice  (NucleoSpin   plasmide   /   plasmide  (NoLid)  Colonne)  après  une  centrifugation  à  14  000  x  g  pendant  1  min.  

Le  liquide  recueilli  a  été  jeté  et  le  NucleoSpin  plasmide  /  plasmide  (NoLid)  Colonne  placé   à   nouveau   dans   le   tube   de   collecte.   Cette   étape   a   été   répétée   afin   de   charger   le   lysat   restant.  La  silice  de  la  colonne  présente  une  grande  affinité  pour  l’ADN  plasmidique  et  va   pouvoir  l’adsorber  au  cours  de  la  filtration.  

La   colonne   replacée   sur   le   microtube   a   été   centrifugée   à   sec   pendant   2   min   à                                               14000   x   g  pour  éliminer  l’éthanol.  Enfin   l’ADN   plasmidique   a   été   recueilli   par   élution  

(=   séparation)   en   ajoutant   50   ɊŽ †‡   tampon   AE   et   en   incubant   pendant   1   min   à   la   température  de   la  salle,   puis  en  centrifugeant  à  14000g  pendant  1  min.