Chapitre II - Elaboration de nanogels de chitosane
1. Préparation du chitosane
1.1. Purification
Le chitosane se présente sous forme d'une poudre blanche. Lorsqu'il est solubilisé, ce chitosane présente de nombreuses impuretés visibles à l'œil nu (filaments, particules). Il est donc nécessaire de le purifier avant toute utilisation.
Tableau 2. Caractéristiques des différents lots de chitosane 114 purifiés pour cette étude.
Lot Rendement DAa W M b(g.mol-1) Đb CS400-1 76 % 3 % (± 0.5%) 410 000 ± 30 000 1.6 ± 0.2 CS400-2 76 % 3 % (± 0.5%) 390 000 ± 20 000 1.7 ± 0.2 CS400-3 68 % 3 % (± 0,5 %) 370 000 ± 30 000 1.7 ± 0.2
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Ainsi, au cours de cette étude, trois séries de purification ont été réalisées. Cette étape, essentielle afin de travailler avec un produit propre de bonne qualité, est très chronophage et fastidieuse. Les étapes de filtration sont particulièrement longues, notamment avec le chitosane de haute masse et de faible DA qui présente une conformation de chaîne plus rigide, et donc une solution plus visqueuse. Le rendement de l’étape de purification ne dépasse pas 80 % (voir Tableau 2).
Le chitosane 114 non purifié présente une masse molaire moyenne en masse de 450 000 g.mol-1 (mesurée par SEC). Cette valeur diminue après purification. Deux explications à ce résultat peuvent être avancées : i) l’étape de purification est longue, et le polymère reste relativement longtemps (jusqu'à 3 jours, à température ambiante) solubilisé dans le tampon acide (pH 4.5) et peut donc s'hydrolyser partiellement; ii) il est possible que les très hautes masses molaires (500 000 g.mol-1 < MW < 1 000 000 g.mol-1), qui peuvent éventuellement s’organiser en agrégats, soient éliminées par la filtration, diminuant ainsi la masse molaire moyenne du chitosane purifié.
1.2. Préparation d'échantillons de chitosane de faible masse molaire
Il ressort des travaux de Fabrice Brunel que, pour avoir les meilleurs résultats en termes de taille et de distribution en taille, il est nécessaire de travailler avec un chitosane de chaîne courte, avec des masses molaires de l’ordre de 20 000 g/mol. La dépolymérisation du chitosane a été réalisée par réaction de désamination nitreuse décrite dans le chapitre précédent. La première étude a été de déterminer la cinétique de la réaction, afin d’être en mesure de prévoir et obtenir la masse molaire, selon les paramètres de réaction utilisés.
1.2.1. Etude cinétique de la dépolymérisation
La Figure 23 présente les résultats de deux études cinétiques de dépolymérisation indépendantes, réalisées sur le chitosane CS400-1 avec un rapport molaire
2 2 0 187
NO / GlcN NaNO GlcN
R n n . . Il apparaît que la masse molaire du chitosane diminue de
façon exponentielle avec le temps. Etant donné la faiblesse des écarts types, la reproductibilité de cette réaction est très satisfaisante.
63 0 20 40 60 80 100 120 0 100000 200000 300000 400000 500000 Mw (g /mo l) Temps (min)
Figure 23. Cinétique de dépolymérisation du chitosane, solubilisé à 0.46 %w/w
dans un tampon acétate 150 mM et avec un rapport molaire
2
NO / GlcN
R = 0.187.
Ces résultats permettent ainsi de prédire la masse molaire selon le temps de réaction utilisé (avec
2
NO / GlcN
R de 0.187).
1.2.2. Préparation des différents échantillons de chitosane de faible masse molaire Une fois l’étude cinétique de la réaction effectuée, la même expérience a été réalisée sur des quantités plus importantes. Pour obtenir un chitosane d'environ 25 000 g.mol-1 (valeur qui selon l'étude de Fabrice Brunel se situe dans une gamme de masse molaire optimale pour obtenir des nanogels avec des tailles et distributions en taille les plus étroites [262]), un temps réactionnel de 90 minutes a été retenu. Les expériences ont été réalisées dans les mêmes conditions que les études cinétiques (chitosane solubilisé à ca. 0.5 % dans une solution tampon acétate 150 mM et un rapport molaire
2
NO / GlcN
R de 0,187. Notons qu’un dégagement gazeux apparaît systématiquement aux premiers instants de la réaction (correspondant au dégagement de diazote de la réaction de désamination) et s’estompe rapidement. Les
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caractéristiques des lots de chitosane utilisés dans ce mémoire sont synthétisées dans le Tableau 3 ci-après.
Tableau 3. Caractéristiques des différents chitosanes préparés.
Lot Chitosane initial Rendement MW a
(g.mol-1) Đ a DAb rCS20-1 yCS400-3 90,7 % 24 000 1,5 3 % yCS20-2 yCS400-2 95 % 22 100 1.3 3 % yCS20-3 yCS400-2 97 % 29 800 1.4 3 % yCS20-4 yCS400-2 92 % 26 700 1.3 3 %
a : déterminé par RMN 1H b : déterminé par SEC, dn/dc = 0,198 mL/g
1.3. Acétylation du chitosane dépolymérisé
Afin d'obtenir des échantillons de DA différents mais de masses molaires comparables, la stratégie a été dans un premier temps de dépolymériser une grande quantité de chitosane, puis, à partir de ce même lot de chitosane de faible masse molaire, de réaliser des réactions d’acétylation en ciblant différents DA.
Les lots CS20-2 CS20-3 et CS20-4 ont été réunis en un seul, constituant ainsi une quantité totale de 47 g de chitosane (MW = 25 800 g/mol et Đ = 1.3). Nous avons préparé, à partir de ce lot mère, 6 lots de chitosane de DA différents par la réaction d’acétylation à l’anhydride acétique (décrite dans le Chapitre I). Les DA visés étaient 10%, 20%, 30%, 40% et 60%.
La masse molaire moyenne du chitosane a une influence sur la viscosité de la solution. Cette dernière est donc un élément essentiel pour l’étape de réacétylation, puisqu’elle va influer sur l’homogénéité du milieu réactionnel. Le choix de dépolymériser le chitosane avant la réacétylation n’est donc pas anodin. Si la réacétylation avait été réalisée avant la dépolymérisation, la réaction aurait pu être plus difficile à maîtriser, en raison d’une viscosité élevée, et la dépolymérisation de chaque lot de chitosane de DA différent n’aurait pas forcément conduit à des masses molaires moyennes en masse similaires (la cinétique de la
65 réaction de dépolymérisation étant notamment dépendante du DA du chitosane [22]), ce qui aurait posé ensuite des difficultés d’interprétation et de comparaison des résultats.
Tableau 4. Résultats des réactions d'acétylation.
Lot DA a M W b (g.mol-1) Đ a Rendement CS20DA10 11 % 33 000 1.4 92 % CS20DA20 20 % 32 000 1.3 97 % CS20DA30 29 % 34 500 1.3 75 % CS20DA40 * 36 % 39 500 1.5 99 % CS20DA60 * 60 % 40 000 1.3 55 %
a : déterminé par 1H-RMN b : déterminé par SEC, dn/dc déterminé suivant Fig. 9
* : purifié par dialyse n.d. : non déterminé
A partir du CS20DA30 (« 20 » pour 20 000 g/mol, et « DA30 » pour degré d’acétylation de 30%), le chitosane se solubilisait partiellement dans les eaux de lavage. Ce résultat n'est pas surprenant puisque la solubilité du chitosane est sensible au DA et à sa masse molaire. Il était donc à prévoir qu'un chitosane de très faible masse molaire, avec un DA élevé présenterait une bonne solubilité dans l'eau. Ainsi, à partir d'un DA d'environ 40 %, le chitosane de faible masse molaire se solubilise dans une eau à pH neutre (eau permutée). Cela peut présenter des avantages pour certaines applications, mais dans le cas présent, cette solubilité a compliqué l'étape de lavage du chitosane.
Le mode de lavage a donc été changé pour les lots de DA40 et de DA60. Il est apparu préférable d’opter pour la technique de dialyse, qui, bien que plus longue, permet d'obtenir de meilleurs rendements (notés par « * » en Tableau 4).
Les valeurs de masses et de DA des échantillons ont ensuite été contrôlées en SEC et RMN 1H. Cette dernière technique permet également de vérifier que le propanediol a été entièrement éliminé lors des étapes de lavage (voir Figure 24). Le spectre caractéristique de cette molécule présente en effet un doublet très net vers 1.1 ppm (voir encart Figure 24), correspondant aux protons du groupement méthyle. Ce pic n'a été observé sur aucun des spectres.
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Figure 24. Spectre RMN 1H du lot CS20DA20. On détermine ainsi le DA du chitosane, et l'absence du doublet du propanediol dans la région de 1.1 ppm est également vérifiée (dans l'encart en haut à droite est représenté le
doublet en question sur le spectre RMN 1H du propanediol).
Ces échantillons de chitosane de différents DA ont pu ensuite être utilisés pour la synthèse de NPsC. Ces résultats feront l’objet de discussion ci-après (paragraphe II-4.1), lorsque la problématique de la cohésion des nanogels sera abordée.