Les prélèvements de surfaces ont été réalisés avant et après N-D sur deux équipements : un tapis convoyeur en PVC (Figure 18) et des machines éplucheuses Townsend® en acier inoxydable conçues pour séparer le périmysium du muscle (Figure 19). Le PVC est souvent utilisé comme matériau de tapis convoyeur dans l’industrie agro-alimentaire en raison de sa flexibilité. Quant à l’acier inoxydable, ce dernier est connu pour sa résistance à la corrosion ainsi que pour ses propriétés hygiéniques.
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Figure 19 : Machine éplucheuse Townsend® en acier inoxydable
1. Prélèvements de surface par chiffonnages
Les surfaces à chiffonner sont délimitées par un gabarit de 566 cm². En effet, les dimensions du gabarit ont été adaptées aux surfaces des machines éplucheuses Townsend®. Avant de procéder aux chiffonnages des équipements, nous avons pris soin d’éliminer les résidus de viande restants sur les surfaces à chiffonner. Une fois les opérations de N-D achevées, nous avons constaté que les surfaces étaient visuellement sèches. Les prélèvements ont été réalisés à l’aide de chiffonnettes stériles imbibés d’un neutralisant polyvalent ATL®
(Humeau, La Chapelle-Sur-Erdre, France) dont le rôle est d’inhiber les principes actifs des désinfectants (Annexe 4). Le chiffonnage est effectué dans trois directions différentes : de gauche à droite, de haut en bas et en diagonale. Cependant des différences au niveau des prélèvements entre la campagne 1 et les campagnes 2/3 sont à noter :
Campagne 1 :
La première campagne nous a permis de fixer notre stratégie de prélèvement et a aussi été l’occasion de collecter des isolats. Elle sera donc uniquement exploitée pour l’étude de l’écosystème cultivable des surfaces (Cf. § 1B p 89). Elle a été menée en cours de semaine (nuit du jeudi au vendredi). Deux séries de 10 chiffonnages successifs ont été réalisées avant et après N-D au même endroit sur un tapis convoyeur en PVC (zones 2 et 4 Figure 20A). Pour les machines éplucheuses Townsend® en acier inoxydable, 10 chiffonnages successifs ont été réalisés avant et après N-D également au même endroit sur deux machines séparées (Figure 21).
Campagnes 2 et 3 :
Ces deux campagnes ont été réalisées à la fin de la semaine (nuit du vendredi au samedi). De plus, nous avons modifié notre stratégie de prélèvement par rapport à la campagne 1 pour les raisons suivantes : (i) les quantifications par qPCR sur acier inoxydable ont donné des résultats très dispersés à la première campagne. Nous avons donc doublé le nombre de surfaces échantillonnées, (ii) nous avons fait plus de chiffonnage sur le PVC pour améliorer l’évaluation
63 des pentes des droites de décrochement, (iii) l’ensemble des chiffonnages réalisés au même endroit avant et après N-D à la première campagne ne permet pas d’évaluer l’efficacité du N-D réalisé par l’industriel puis que les chiffonnages successifs à eux seul constituent un nettoyage. Nous avons donc choisi de faire les prélèvements avant et après N-D sur des surfaces juxtaposées : deux séries de 15 chiffonnages successifs ont été réalisées sur un tapis convoyeur en PVC. Les zones chiffonnées avant N-D (zones B et D, Figure 20B) sont juxtaposées à celles chiffonnées après N-D (zones A et F, Figure 20B). Pour les machines éplucheuses Townsend®, 10 chiffonnages successifs ont été réalisés sur 4 machines avant N-D et 4 autres machines après N- D (Figure 21).
Une fois les prélèvements achevés, les chiffonnettes sont conservées dans des glacières contenant des plaques eutectiques avant d’être traitées au laboratoire dans les 24 heures qui suivent.
Figure 20 : Représentation schématique de la surface d’un tapis convoyeur en PVC. La bande de couture du tapis convoyeur nous a permis de délimiter les zones à analyser. A : Prélèvements de surfaces à la campagne 1. Les zones 2 et 4 ont servi aux chiffonnages successifs avant et après N-D. Les zones 1 et 3 ont servi aux empreintes gélosées avant et après N-D. B : Prélèvements de surfaces aux campagnes 2 et 3. Les zones B et D ont servi aux 15 chiffonnages successifs avant N-D et les zones A et F aux 15 chiffonnages successifs après N-D. Les zones C et E ont servi aux empreintes gélosées avant et après N-D.
Zone A 15chifo nnages
Zone B Zone C Zone D Zone E Zone F
Bande de couture du tapis convoyeur Zone 1 Zone 2 Zone 3 Zone 4 A B
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Figure 21 : Gabarits utilisés pour les prélèvements par chiffonnages (gabarit blanc de droite) et empreintes gélosées (gabarit gris de gauche). Pour la première campagne, les prélèvements par chiffonnage et empreintes ont été réalisés sur les mêmes surfaces avant et après N-D. Pour les campagnes 2 et 3, les prélèvements par chiffonnage et empreintes ont été réalisés sur 4 machines avant N-D et 4 autres machines après N-D.
2. Prélèvement de surface par empreintes gélosées
Des empreintes par un milieu gélosé Tryptone Soya Agar, TSA (Oxoid, Dardilly, France) supplémenté avec du neutralisant polyvalent ATL®à 10% (Humeau) ont été réalisées sur le tapis convoyeur en PVC et sur les machines éplucheuses Townsend®, sur des surfaces juxtaposées à celles échantillonnées par chiffonnage. Les boîtes contact ont été clipsées sur un applicateur adapté ATL® (Humeau), conforme à la norme ISO 18593 (Anonyme, 2004) de prélèvements de surfaces en agroalimentaire (temps de contact : 10 secondes, pression appliquée : 25g/cm² de gélose, Figure 22). Les empreintes ont été réalisées avant et après N-D exactement au même endroit (Figure 20 pour PVC et Figure 21 pour acier inoxydable). Pour cela, nous avons utilisé un gabarit perforé de 6 cercles. La superficie de contact de la gélose est de 20 cm2. Deux empreintes successives ont été réalisées dans chaque cercle, à un intervalle de temps de 10 secondes. Une fois au laboratoire, les boîtes contact de TSA ont été incubées à 25°C pendant 24 heures pour les prélèvements avant N-D. Pour les empreintes réalisées après N-D, les boîtes contact de TSA ont été incubées 6 jours puis la durée prolongée jusqu’à 14 jours. Pour cela, les boîtes ont été emballées de façon non hermétique dans un sac contenant un papier imbibé d’eau stérile pour éviter qu’elles ne se dessèchent. Cette dernière étape n’entraîne pas l’anaérobiose comme en atteste la croissance de colonies d’espèces aérobies strictes, des Pseudomonas, observée entre 6 et 14 jours d’incubation.
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Figure 22 : Boîte contact TSA clipsée sur l’applicateur ATL®
3. Prélèvements d’air
Afin d’évaluer la charge bactérienne qui se dépose sur les surfaces, 12 boîtes de Petri contenant de la gélose blanche à 15g/L (Oxoid) ont été réparties dans la salle de découpe comme suit :
- 2 boîtes placées sur un boîtier électrique à 1m 80 du sol à côté d’une machine éplucheuse - 3 boîtes placées sur une table à 1m 40 du sol à côté d’une machine éplucheuse
- 2 boîtes placées au dessus du tapis convoyeur à 1m 40 du sol
- 2 boîtes placées sur un boîtier électrique à 1m 80 du sol, entre une machine éplucheuse et un tapis convoyeur
- 3 boîtes placées sur une table à 1m 40 du sol à côté d’une machine éplucheuse.
Les 12 boîtes de gélose blanche ont été laissées ouvertes pendant les 6 heures correspondant au pic d’activité de l’atelier. Elles ont été ensuite fermées puis expédiées au laboratoire pour les analyses. La gélose blanche a été décrochée des boîtes de Petri à l’aide d’une spatule stérile puis déposée dans des sacs stériles type Stomacher munis d’un filtre. Vingt cinq millilitres d’eau peptonnée 1g/L (VWR, Fontenay-sous-Bois, France) sont ajoutés et la gélose passée dans un homogénéisateur péristaltique pendant 1 minute (AES laboratoire, Combourg, France) pour en décrocher les cellules bactériennes et procéder par la suite à un dénombrement des UFC sur milieu TSA à 25°C pendant 3 jours.
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