Prélèvement des tissus embryonnaires

Les embryons sont prélevés au stade approprié, rincés dans un tampon phosphate salin (PBS 1X de pH 7,4 composé de 8g/l de NaCl (Merck), 0,2 g/l de KCl (Merck), 0,2 g/l de KH2PO4

(Merck) et 1,442 g/l de Na2HPO4/2H2O (Merck)) et les tissus sont disséqués dans du milieu de

culture ou dans une solution de sels de Tyrode (Gibco BRL ou Sigma) à 9,5 g/l dont le pH (7,4) est tamponné avec une solution de NaHCO3 (Merck). Les dissections sont réalisées sous une loupe

binoculaire.

1. Plaque neurale médiane

La région médiane de la plaque neurale caudale, située entre le dernier somite individualisé et le nœud de Hensen, est prélevée chez des embryons de 1,5 jours de développement (E1,5/stade HH 10). L’embryon, épinglé face ventrale vers l’expérimentateur, est incubé dans une solution de trypsine à 0,1% dans du Tyrode durant 5 à 10 min., pendant lesquelles, l’endoderme, le mésoderme paraxial non segmenté et la chorde sont retirés, du dernier somite formé au nœud de Hensen, à l’aide d’une aiguille à insecte de 0,2 mm de diamètre. La réaction enzymatique est alors arrêtée avec du milieu de culture SFRI4 riche en sérum (SFRI4 à 10% de FCS). Le tiers médian (environ) de la largeur de la plaque neurale caudale -selon le futur axe dorso-ventral- est ensuite découpé longitudinalement de part et d’autre de la floor plate et transversalement en arrière du dernier somite formé et légèrement en avant du nœud de Hensen (figure 74) avec une fine aiguille à insecte (0,1 mm de diamètre), selon la méthode décrite par Yamada et collaborateurs (Yamada et al., 1993).

2. Tube neural ventral

La région ventrale de la portion du tube neural qui s’étend du niveau cervical (postérieur au rhombencéphale) au niveau lombaire (faisant face aux bourgeons de membres postérieurs) est prélevée chez des embryons de E3,5 à E4,5 (stades HH 22 à 25). La dissection est réalisée dans une solution de sels de Tyrode, l’embryon étant épinglé face dorsale vers l’expérimentateur. L’ectoderme est décollé de la surface du tube neural avec des pinces fines et éliminé. Le tube neural est ouvert dorsalement, le long de la roof plate, du niveau cervical au niveau lombaire, au moyen d’un micro-scalpel et dégagé des tissus environnants (des somites de part et d’autre et de la chorde dessous) avec une aiguille à insecte, puis coupé au niveau des limites antérieure et

Figure 74 : Dissection de la partie médiane de la plaque neurale caudale chez un embryon de poulet de stade HH 10 (E1,5). Les axes rostro-caudal ou antéro-postérieur (A : antérieur ; P :

postérieur), médio-latéral (M : médian ; L : latéral) et dorso-ventral (D : dorsal ; V : ventral) sont représentés par les doubles flèches noires. A) Vue dorsale schématique d’un embryon de poulet de stade HH 10. B) Agrandissement du cadre en A. La plaque neurale caudale s’étend du dernier somite individualisé au nœud de Hensen (régions jaunes et rosée situées entre les deux doubles flèches bleues). La zone prélevée est la partie médiane de la plaque neurale caudale, appelée plaque neurale médiane (région rosée), comprenant la floor plate au milieu (délimitée par les pointillés gris). Ce territoire correspond grossièrement au tiers médian de la largeur de la plaque neurale caudale selon l ’axe médio-latéral, futur axe dorso-ventral. C) Vue en coupe transversale de

C

B

A

plaque neurale médiane plaque neurale intermédiaire bourrelets neuraux

plaque neurale médiane plaque neurale intermédiaire bourrelets neuraux





131 postérieure de l’ouverture de la roof plate avec des Pachefs. Le tube neural est alors épinglé, face externe au dessus, et débarrassé du mésenchyme adhérent et des racines ventrales des neurones ventraux. Dans cette configuration, la partie ventrale du tube neural, de part et d’autre de la floor

plate, et les deux demi parties dorsales qui flanquent la partie ventrale latéralement peuvent être

aisément distinguées. La limite entre les régions ventrale et dorsale ainsi différenciées est appelée le sulcus limitans. Les 2 régions dorsales du tube neural sont ensuite découpées sur toute sa longueur (selon l’axe antéro-postérieur), le long du sulcus limitans avec un micro-scalpel et écartées. De la même façon, chaque moitié de tube neural ventral est découpée le long de la floor

plate qui est grossièrement éliminée. Chacun des 2 territoires ainsi isolés est divisé

transversalement en 30 à 40 explants, aussitôt placés en culture. 3. Neuroépithélium ventral

Le neuroépithélium ventral du tube neural cervico-brachial est prélevé chez des embryons de E4,5-5 et E6 (stades HH 25-26 et 29, respectivement), selon une méthode mise au point au laboratoire (Soula et al., 2001). Le tube neural est dégagé des tissus environnants comme ci-dessus, sectionné en arrière du rhombencéphale et au niveau des bourgeons de membres antérieurs, puis inclus dans un gel d’agarose (Sigma) à 3% dans du PBS 1X, liquide à 37°C. Des coupes transversales de 80 à 100 µm d’épaisseur sont réalisées dans le bloc d’agarose (solide à température ambiante) au moyen d’un vibratome (EMS, Microm ou Leica) dont la cuve réfrigérée contient du PBS 1X. Les coupes sont conservées dans du milieu de culture, à 4°C, jusqu'à la dissection du neuroépithélium. Sur ces coupes, les différentes structures du tube neural (neuroépithélium, floor

plate et zone du manteau) sont identifiables grâce à leur réfringence différentielle sous une loupe

binoculaire. La limite entre les régions ventrale et dorsale du tube neural est définie morphologiquement par la position du sulcus limitans et par le fait que le neuroépithélium dorsal est plus large que le ventral, à ces stades. Les coupes sont ensuite débarrassées de l’agarose entourant le tube neural. Un fragment de neuroépithélium ventral est prélevé sur chaque section après 2 incisions perpendiculaires à l’axe dorso-ventral, l’une réalisée ventralement au sulcus

limitans et l’autre dorsalement à la floor plate, et une incision parallèle à cet axe, faite dans le

neuroépithélium afin d’éviter d’emporter du tissu de la zone du manteau. Ces opérations sont réalisées au moyen d'aiguilles à insecte de 0,1 mm de diamètre. L’accès au neuroépithélium est facilité par la rupture de la roof plate lors du prélèvement du tube neural. Les explants de neuroépithélium ventral ainsi obtenus sont placés dans du milieu de culture, à 4°C, jusqu’à la fin de la dissection.