Doma ines prédits pour les protéines Pob3 de Paramecium tetraurelia (rectangles colorés) B Arbre phylogénéti que des

protéi nes Pob3 chez Paramecium tetraurelia etàd aut esàeu a otesà àpartir des alignements des séquences des protéines enti ères par MUSCLE. La phylogénie des alignements est réalisée vi a PhyML 3.0 s ur Phyl ogeny.fr a vec une procédure de oost apà à à ootst aps.àL a eàestà isualis àa e àT ee.D à . .àLesàs ue esàp ot iques et leurs numéros d a essio à so tà i di u sà e à Annexe 3/Figure S1. P.t. Paramecium tetraurelia, T.t Tetrahymena thermophila, S.p.

Schyzosaccharomyces pombe, S.c. Saccharomyces cerevisiae, C.e. Caenorhabditis elegans, D.m. Drosophila melanogaster,

H.s . Homo sapiens, M.m. Mus musculus, A.t. Arabidopsis thaliana. C. P ofilsàd e p essio àdesàg esàPOB3 pendant une i ti ueàd autoga ieàpa à esu eàdesà i eau àd e p essio àdesàá‘N àpa à‘Náse à(Arnaiz et al., 2017). La description des poi nts est disponible dans la légende de la figure 1 de (Touzeau et a l., en prep). D. Létalité de la progéniture sexuelle a près i na ctivation des gènes POB3-1 et PGM.àLeàg eà i l àda sà ha ueàe p ie eàd á‘Nài te f e eàestài di u .àDeu à fra gments non chevauchants (#1 et #2) de POB3-1 sont utilisés i ndépenda mment. Les gènes ND7 ou ICL7 s ont uti l i s és comme contrôles gatifsàpuis ueàleu ài a ti atio à aàau u àeffetàsu àlesà e e tsàse uelsà(Bouhouche et al., 2011). L autoga ieàestàaussià e eàda sàu à ilieuàsta da dàsuppl e t àe àK. pneumoniae oà‘Nái .àL i a ti atio àdeàPGM, comme a ttendu, induit la l étalité de la progéniture sexuelle (Baudry et al., 2009). Les cellules s ont restreintes en nourri ture pou ài dui eàl autoga ieàetàap sà àouà àjou sàdeà est i tio àali e tai e,àlesà ellulesàautoga esàs ont transférées i ndividuellement en milieu K. pneumoniae pour observer la croissa nce de l a progéni ture s exuel l e. Le nombre tota l de ellulesàautoga esàa al s esàda sà ha ueàe p ie eàd á‘Nài te f e eàetàleà o eàd e p ie esài d pe da tesà e t eà pa renthèses) sont indiqués. E. Létalité de la progéniture sexuelle a près inactivation des gènes POB3-1 et PGM penda nt l a o jugaiso .àLeàg eà i l àda sà ha ueàe p ie eàd á‘Nài te f e eàestài di u .àDeu àf ag e tsà o à he au ha tsà # à et #2) de POB3-1 s ont utilisés i ndépendamment. Les gènes ND7 ou ICL7 s ont utilisés comme contrôle négatifs puisque l eur i a ti atio à aàau u àeffetàsu àlesà e e tsàse uelsà(Bouhouche et al., 2011).àL autoga ieàestàaussià e eàda sàu à

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mi l ieu s tandard s upplémenté en K. pneumoniae oà‘Nái .àL i a ti ation de PGM, comme attendu, induit la létalité totale de l a progéniture s exuel l e (Ba udry et a l ., 2009). Les cel l ul es de s i gne s exuel oppos é s ont mél a ngées en mi l i eu K.

pneumoniae pour conjuguer et les paires en méiose/caryogamie sont mises en milieu RNAi pour i nactiver l es gènes pendant

l e développement macronucléaire. Après un jour de RNAi, les individus issus de la s éparation des pa i res s ont tra ns férés i ndividuellement en milieu K. pneumoniae pour observer la croissa nce de l a progéni ture s exuel l e. Le nombre tota l de ellulesàautoga esàa al s esàda sà ha ueàe p ie eàd á‘Nài te f e eàetàleà o eàd e p ie esài d pe da tesà e t eà pa renthèses) sont indiqués. F. Analyseàpa àPC‘àdeàl e isio àdeàdeu àIESà àl aideàd a o esàdeà ha ueà ôt àdeàl IESà àl issu e deàl autogamie. A droite sont listés les noms des IES et à gauche les tailles des IES correspondantes. Le gène ciblé par l i a ti atio àestài di u .àL autoga ieàestàa ussià e eàe à o ditio àsa sà‘Náiàouàe à‘Náià o t ôle.àCo eàatte du,àilà àaà pasàdeà te tio àd IESàe à o ditio àsa sà‘Náià oà‘Nái àouàe à‘Náià o t ôleà o t olà‘Nái à aisàlesàIESàso tà ete uesà qua nd PGM ou SPT16-1 s ont i nactivés. Dans chaque piste, la bande du haut correspond à l a forme non excisée et l a ba nde du ba s corres pond à l a forme exci s ée ma jori ta i rement a mpl i fi ée à pa rti r des fra gments du MAC ma ternel .

2. Po 3 ’est pas essai e au v e e ts se uels i au d veloppe e t MAC

Pou à d te i e à l i pli atio à deà Po - à da sà leà d eloppe e tà etàl li i atio àd áDN,à ousà a o sà i a ti à leà g eà o espo da tàpe da tàl autoga ieàpa àá‘Nài te f e eàa e à deux fragments non chevauchants du gène POB3-1 (#1 et #2) (Figure 14D). Le protocole utilisé est le même que celui décrit dans (Touzeau et al., In preparation) pou àl i a ti atio à de SPT16-1. Les cellules sont mises en restriction alimentaire et entament leur autogamie da sà leà ilieuà d i a ti atio .à Lesà ellulesà autoga esà so tà e suiteà isol esà da sà u à ilieuà classique pour mesurer leur capacité à produire une progéniture sexuelle viable. Comme atte du,à ilà à aàpasàp odu tio àdeàp og itu eàse uelleà ia leàap sàl i a ti atio àdeàPGM. En revanche, on observe la production d_{u e p og itu eà se uelleà ia leà à l issueà deà} l i a ti atio àdeàPOB3-1, comme observée en RNAi contrôle. On en conclut que Pob3- à està do à pasà essai eà à l o te tio à deà p og itu eà se uelleà ia leà à l issueà deà l autoga ie.à áfi à deà est ei d eàl i a ti atio àdeàPOB3-1 au développement MAC, nous avons inactivé le gène avec deux fragments non chevauchants (#1 et #2) pendant la conjugaison (Figure 14E). Des cellules sexuellement réactives de signes sexuels complémentaires sont mélangées et lesà ouplesàso tàisol sàetàt a sf sàe à ilieuàd i a ti atio .àLo s ueàlesà ouplesàseàs pa e t,à les exconjuguants sont transférés individuellement dans un milieu classique sans RNAi et on suit la capacité de la progéniture sexuelle à reprendre la croissance végétative. Comme o se à à l autoga ie,à lo s ueà POB3-1 est inactivé, on obtient une progéniture sexuelle viable comme en RNAi contrôle. Nous avons conclu que POB3-1 taità pasà essai eà auà développement macronucléaire.

Il est possible que même si la protéine Pob3- _{à estàpasàesse tielleà àl o te tio àd u eà} p og itu eàse uelleà ia le,àelleàpuisseà t eài pli u eàda sàlesà a a ge e tsàd áDN.àPou à tester cette hypothèse, nous avons inactivé POB3-1 avec deux fragments non chevauchants

143 # àetà# àpe da tàl autoga ieàetàa al so sàpa àPC‘àl e isio àdeàdeu àIES.àLes réactions PCR so tà alis esà su àl áDNàe t aitàdeà ellulesà àlaàfi àduàd eloppe e tàMáCàe àutilisa tàdesà a o esà deà pa tà età d aut es des extrémités de chaque IES. En RNAi contrôle et en absence deà‘Nái,à o eàatte du,àseuleàlaàfo eà o espo da tà àl IESàe is eàestàd te t eàda sàlaà progéniture sexuelle. En RNAi PGM ou SPT16-1, comme attendu on détecte la forme excisée deàl IESàp o e a tàdesàf ag e tsàduàMáCà ate elàetàlaàfo eà o àe is eàdeàl IESài di ua tà que Pgm et Spt16- _{à so tà ie à essai esà au à a a ge e tsà d áDN.à Pa à o t eà lo s ueà} l o ài a ti eàPOB3-1 avec les deux fragments non chevauchants (#1 et #2), on observe que la forme non excisée des deux IES. On en conclue que POB3-1 _{estàpasà essai eà àl e isio à} de ces deux IES. Etant donné les résultats que nous avons observés, il semble que POB3-1 ne soità pasà a teu à ajeu à desà a a ge e tsà d áDNà o eà SPT16-1. L e se leà de ces résultats étant négatifs il est difficile de donner une conclusion définitive tant que nous a o sàpasàl assu a eà ueàPOB3-1 a bien été inactivé en contrôlant par exemple le niveau d á‘N àPOB3-1.

3. Pob3 est localisé dans les macronoyaux en développement

áfi à d e a i e à laà lo alisatio à su ellulai eà deà laà p ot i eà Po -1 chez P. tetraurelia, nous avons inséré la GFP en amont du codon STOP du gène POB3-1.àL e p essio àduàg eàestà contrôlée par les séquences régulatrices endogènes amont et aval de POB3-1. Le transgène Pob3-1-GFP est micro-injecté dans le macronoyau végétatif (Figure 15A). Par fixation au cours du cycle de vie de cellules injectées Pob3-1-GFP, nous ne parvenons pas à détecter la protéine de fusion pendant la croissance végétative, ni pendant la méiose. La protéine de fusio à s a u uleà p o e e tà da sà lesà a o o au à e à d eloppe e tà età pe sisteà deà manière diffuse dans le nouveau MAC après la première division cellulaire. Elle est aussi d te t eàda sàlesàMICàlo s u appa aisse tàles MAC en développement. Afin de déterminer si la protéine Pob3-1-GFP nucléaire est localisée dans le nucléoplasme et soluble ou bien associée à la chromatine, nous avons comparé deux conditions de fixation des cellules transformées avec Pob3-1-GFP au cours du développement. Nous avons perméabilisé avant de fixer les cellules transformées avec Pob3-1-GFP au cours du développement ou bien nous avons fixé (sans perméabilisation préalable) les mêmes populations de cellules (Figure 15B). On suppose que si la protéine Pob3- à està pasà asso i eà fo te e tà à laà h o ati e,à elleà

144 devrait être extraite des noyaux, et moins de fluorescence GFP serait détectée en présence des détergents utilisés pour perméabiliser (Triton X- à à % .àNousàa o sà esu àl ai eàdesà MAC en développement ainsi que la quantité de signal GFP dans le MAC au cours du d eloppe e tà à pa ti à d i agesà a uisesà e à i os opieà o fo ale,à pou à à o au àda sà ha ueà o ditio .à Cetteà a al seà o t eà ueà l ai eà desà o au à està plusà petiteà lo s u o à perméabilise avant de fixer les cellules (Figure 15C). En normalisant le signal de fluorescence pa à l ai eà desà o au à Figu eà 15C), on observe que le signal GFP dans les MAC en d eloppe e tà està pasà odifi à pa à laà pe a ilisatio .à Leà sig alà deà fluo es e eà està diminué par la perméabilisation des cellules mais cette diminution est la conséquence de la di i utio à deà l ai eà desà o au .à Laà o e t atio à deà Po -1-GFP dans les MAC est donc constante dans la fenêtre développementale analysée dans les deux types de conditions expérimentales. En revanche, le signal GFP dans les micronoyaux disparaît lorsque les cellules sont perméabilisées. Ces résultats indiquent que Pob3-1-GFP est plus facilement extraite des MIC que des MAC en développement. Ces observations suggèrent que Pob3-1- GFP est fortement associée à la chromatine dans les MAC en développement.

En conclusion, même si POB3-1 aàu àp ofilàd e p essio àt sàsi ilai eà à eluiàdeàSPT16-1, osà e p ie esà o tà pasà pe isà deà ett eà e à ide eà u à ôleà deà Po à da sà leà développement macronucléaire. Aucun domaine de dimérisation nécessaire pour l i te a tio àa e àso àpa te ai eàSpt - àauàsei àduà o ple eàFáCTà aàpuà t eàide tifi àda sà la protéine Pob3- .à Nousà a o sà do à pasà d ide eà ueà Po -1 soit un partenaire de Sp16-1.

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Figure 15 : Localisation de la protéine Pob3- à l’aide d’u e fusio p ot i ue à la GFP