Al i gnement par Muscle des domaines MBD des homol ogues de Spt16 de P tetraurelia etàd aut esàeu a otes.àLesà

doma ines identifiés par Interpro sont indiqués en couleur a vec l eurs noms. Les résidus conservés s ont i ndi qués pa r une *. Les couleurs noires signalent des acides aminés identiques. Les couleurs grises i ndiquent la conserva tion d a idesàa i sà a vec des propri étés phys i co-chi mi ques i denti ques . P.t. Paramecium tetraurelia, T.t Tetrahymena thermophila, S.p.

Schyzosaccharomyces pombe, S.c. Saccharomyces cerevisiae, C.e. Caenorhabditis elegans, D.m. Drosophila melanogaster,

H.s . Homo sapiens, M.m. Mus musculus, A.t. Arabidopsis thaliana. B. P odu tio àdeàp og itu eàse uelleà ia leà àl issueàde à l autoga ieàap sà o pl e tatio àduà‘NáiàSPT16-1 par les transgènes RNAi résistants GFP-Spt16-1 et par GFP-Spt16- 1_ΔMBD. Le gène ciblé dans cha ueàe p ie eàestài di u .àL i a ti atio àestà alis eàda sàdesà ellulesà o ài je t es (NI) ou des cellules tra nsformées par GFP-SPT16-1 ou des cellules transformées par GFP-SPT16-1_ΔMBD. Le gène ICL7 est utilisé o eà o t ôleà gatifàduà‘Nái,àpuis ueàso ài a ti atio à aàau u àeffetàsu àlesà e e tsàse uelsà(Bouhouche et al.,

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2011). Comme a ttendu, le RNAi SPT16- à duitàd asti ue e tàlaàp odu tio àdeàp og itu eàse uelleà ia le.àL a se eàdeà l étalité dans les cellules tra nsformées par GFP-SPT16-1 en RNAi ICL7 i di ueà ueàlaàp se eàduàt a sg eà aàpasàd effetà to i ue.àLesà ellulesàso tà isesàe à est i tio àali e tai eàda sàlesà ilieu àd i a ti atio àpou ài dui eàl autoga ieàetàap s 3 ou 4 jours de restriction alimentaire, des cellules autogames sont transférées indivi duel l ement en mi l i eu K. pneumoniae pour s uivre la ca pacité de la production de la progéniture sexuelle à reprendre la croissance végétative. Le nombre total de cel l ules a utogames a nalys ées pour cha que RNAi et leà o eàd e p ie esài d pe da tesàso tài di u sà e t e à pa renthèses). La l étalité dans la progéniture après l e RNAi SPT16-1 est observée après moins de trois divis i ons . C. Ana l ys e pa àPC‘àdeàl e isio àdesàIESsà á àetà G à àl aideàdeàd a o esàs itu esàdeàpa tàetàd aut eàdeàl IESà àlaàfi àde à l autoga ie.àLeàg eà i l àda sà ha ueàe p ie eàd i a ti atio àestài di u .àL autoga ieàestàaussià e eàsa sà‘Náià oà ‘Nái àouàe à‘Náià o t ôle.àL i a ti atio àestà e eàda sàdesà ellulesà o ài je t esà NI , transformées par les transgènes RNAi -résistant GFP-SPT16-1 ou GFP-SPT16-1_ΔMBD. Co eàatte du,àilà àaàpasàdeà te tio àd IESàe à‘Náià o t ôleàouà sa sà‘Nái.àDa sà ha ueàpiste,àlaà a deàduàhautà o espo dà àlaàfo eà o àe is eàdeàl IESàta disà ueàlaà a deàduà asà o espo dà àlaàfo eàe is eàdeàl IESàetàp o ie tàesse tielle e tàdesàfragments du MAC maternel. D. Superposition de projecti ons en Z de GFP-Spt16-1 et GFP-Spt16-1_ΔMBD (vert) et de Hoechst (rouge) pendant le développement ma cronucléaire de cellules tra nsformées par GFP-Spt16-1 ou GFP-Spt16-1_ΔMBD en RNAi contrôle ou RNAi SPT16-1. Les cercl es pointillés blancs indiquent l es MACs en développement. Les a utres noyaux colorés pa r l e Hoechs t corres pondent au àf ag e tsàduàMáCà ate el.àL helleàestàdeà ൠ.àáàgau heàso tàdo sàlesà o esàdeà opiesà elatifsàdesà tra ns gènes GFP-SPT16-1 et GFP-SPT16-1_ ΔMBD esu sàpa à PC‘à àl aideàd a o esàsp ifi uesàdeàlaàGFP.àLesà o esà deà opiesàso tà o alis sàsu àl a ti eàa plifi eà àl aideàd a o esàsp ifi ues.àLesà o esàdeà opieà elatifsàdesàdeu à tra ns gènes s ont qua s i ment i denti ques .

II.

Ide tifi atio àd ho ologuesàdeàPo à hezàParamecium tetraurelia

Chezà tousà lesà eu a otes,à leà o ple eà FáCTà està o pos à deà Spt à età d u eà p ot i eà Pob3 chez S. cerevisiae et S. pombe ou Ssrp1 chez les autres espèces (Jeronimo and Robert, 2016). Ce partenaire de Spt16 de plus petit poids moléculaire interagit aussi avec le u l oso eà età seà fi eà à Spt à iaà leà do ai eà deà di isatio à u ilàposs deàe àN-terminal (domaine D). Si Ssrp1 comme Spt16 sont essentielles chez les eucaryotes, chez certains champignons comme S. pombe, la délétion de POB3 ne provoque pas de létalité.

1. Ide tifi atio d’ho ologues de la p ot i e Po 3 hez Paramecium tetraurelia

áfi à d ide tifie à u à e tuelà pa te ai eà deà Spt -1, nous avons entrepris de rechercher des homologues de Pob3 et Ssrp1 chez Paramecium tetraurelia. En utilisant comme requête la protéine Pob3 de S. cerevisiae, nous avons identifié par Blast dans le génome MAC de P.

tetraurelia 3 homologues de Pob3 : Pob3-1, Pob3-2a et Pob3-2c qui présentent des

domaines fonctionnels homologues de Pob3 (Figure 14A et B) (Aury et al., 2006). Comme pour Spt16, et contrairement à la majorité des eucaryotes, Pob3 est codée par plusieurs g es.à áà l aideà desàs ue esàdesàp ot i esàPo àdeà P. tetraurelia et de leurs homologues eucaryotes, nous avons construit un arbre phylogénétique. Les protéines de paramécie groupent ensemble et sont relativement divergentes de leurs homologues eucaryotes. Les protéines Pob3-2a et 2b sont des duplicats issus de la dernière duplication globale du génome (Aury et al., 2006). Nous avons également observé que comme pour Spt16-1,

140 l e se leà desà esp esà deà Paramecium ont au moins une protéine de la famille Pob3-1 et une protéine de la famille Pob3-2 (Annexe 3/Figure S1). Le nombre de duplicats dans chaque famille varie cependant beaucoup plus que pour Spt16-1 avec certaines espèces de

Paramecium ayant deux Pob3-1 ou trois Pob3- .àL a al seàdesàp ofilsàd e p essio àdesàg esà POB3 pa à esu eà desà i eau à d á‘N lo sà d u eà i ti ueà d autoga ieà e à o ditio sà

sauvages montre que les gènes POB3-2a et 2c sont hautement exprimés tout le long du cycle de vie y compris en conditions de croissance végétative (Figure 14C). Le gène POB3-1 est e p i à u i ue e tà pe da tà l autoga ieà a e à u à p ofilà d e p essio à t sà si ilai eà à eluià de PGM ou de SPT16-1. Ces observations suggèrent que Pob3-1 pourrait être un partenaire de Spt16- _{,ài pli u àda sàleàd eloppe e tàetàl li i atio àd áDN.}

Nous a o sà a al s à laà p se eà deà do ai esà p ot i uesà à l aideà d I te p oà da sà lesà protéines Pob3 de P. tetraurelia (Figure 14A). Elles présentent une organisation modulaire similaire à leurs homologues eucaryotes avec en C-terminal une extrémité riche en résidus acides correspondant au domaine C interagissant avec les histones H2A-H2B (Hoffmann and Neumann, 2015) et en amont un domaine M également nommé domaine Ssrp1 (Zunder et al., 2012).àCepe da t,ào ào se eà u ilà àaàpasàdeàdo ai eàe àN-terminal N/D qui permet normalement la dimérisation avec Spt16 (Winkler et al., 2011). Enfin en C-terminal, on ne détecte pas le domaine HMG présent dans Ssrp1, absent de Pob3 chez les champignons. L o ga isatio à desà p ot i esà deà pa a ieà esse leà plusà à elleà deà Po à ueà deà Ss p .à Pou ta t,à l a se eà deà do ai eà putatifà deà di isatio à eà soutie tà pasà l h poth seà deà formation de dimère Pob3-1/Spt16-1. Cette organisation sans domaine HMG ni domaine de dimérisation est conservée chez les autres espèces de Paramecium que nous avons observées.

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Figure 14 : Ide tifi atio d’ho ologues de Po hez Pa a e iu tet au elia