Prédiction de la structure 3D de la kinase Fyn en conformation DFG-out

Afin d’étudier l’interaction des inhibiteurs type II et la kinase Fyn en conformation DFG-out, nous avons considéré intéressant de prédire la structure tridimensionnelle de cette conformation en utilisant l’approche de la modélisation par homologie grâce à l’application Modeller.

Vu la similarité importante de plus de 83% entre les deux domaines kinases de Fyn et Src, nous avons choisi comme templete la protéine Src kinase, dont le domaine kinase en complexe avec l’imatinib est cristallisé (2OIQ)194.

Parmi les 100 modèles générés par Modeller 9.11, nous avons choisi le modèle au DOPE score le plus faible. La figure 44 montre la structure 3D de la kinase Fyn en DFG-out et en DFG-in.

Figure 44: La structure 3D de Fyn kinase. (a) Modèle prédit de Fyn kinase en conformation DFG-out. (b) Fyn kinase cristallisée en conformation DFG-in. Les cercles entourés en rouge représentent le site de liaison de Fyn kinase.

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4.4.2. La validation de la structure 3D de la kinase Fyn

Le modèle de domaine kinase de Fyn en conformation DFG-out est validé par les outils de validation : Procheck, Errat et Verify 3D.

Selon le graphe de Ramachandran illustré dans la figure 45, 91.6% de résidus se distribuent dans les régions les plus favorisées et 0.0% de résidus dans les régions non admises.

Le score de résultat d’analyse par Verify 3D de modèle de Fyn kinase est faible par 55.04%, alors que celui de templete 2OIQ est de 96.99%. La vérification manuelle des paramètres de chaque résidu utilisée par l’outil Verify 3D pour déterminer le score, démontre que la séquence de Fyn kinase de l’acide aminée 260 à 412 et qui incluse le site de liaison de l’ATP est corrélée à 79% avec le templete (voir l’annexe 5), ce qui affirme que le modèle et principalement le site de liaison de l’ATP est bien prédit.

Figure 45 : La validation de modèle prédit par homologie de Fyn en conformation DFG-out. (a) Le graphe Ramachandran. (b) Le graphe d’analyse par Errat.

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Ce facteur doit atteindre 90 si on enlève la partie en aval de la kinase Fyn prédite qui est loin du site catalytique.

D’après les résultats d’analyse par les trois outils cités ci-dessus, le modèle de la kinase Fyn est considéré conforme et adéquat pour appliquer le Docking moléculaire avec ces ligands.

4.4.3. Comparaison entre les deux conformations de la kinase Fyn

Pour élucider les principales différences entre les conformations DFG-in et DFG-out de la kinase Fyn, on a réalisé une superposition de leurs structures 3D, tout en éclairant les résidus clés de leur site actif. Également, on a visualisé la poche de fixation de ligand au niveau de la kinase Fyn en ces deux conformations.

Figure 46 : Comparaison entre les deux conformations de la kinase Fyn. (a) Le site actif de la kinase Fyn en conformation DFG-out. (b) Le site actif de la kinase Fyn en conformation in. (c) La superposition de structure de la kinase Fyn en conformation in et DFG-out ; en vert, la kinase Fyn en conformation DFG-DFG-out, et en gris, la kinase Fyn en conformation DFG-in.

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En effet, on a constaté que le volume du site actif de la kinase Fyn en DFG-out soit assez grand par rapport à celui de Fyn kinase en DFG-in.

Cette différence en volume de site actif due à la flexibilité de la boucle (P-loop) qui tend vers le haut pour la Fyn kinase en DFG-out et à la boucle d’activation sur laquelle la Phe de motif DFG s’oriente vers l’extérieur de la poche de Fyn kinase en DFG-out ce qui permet la création d’une nouvelle poche hydrophobique (la poche C dans la figure 46 (a)).

Les autres résidus de la charnière, du gatekeeper, du motif HRD, et la Glu de α-hélice gardent la même orientation au niveau des deux conformations de la kinase Fyn.

Les deux conformations de la kinase Fyn ont été vérifiées en analysant la distance D1 qui relie l’Asn (N) près du motif HRD (HRDXXXXN) et la Phe du motif DFG, la distance D2 entre l’atome Cα de la Glu conservée de l’hélice Cα et celle de la Phe du motif DFG, et la distance D3 entre l’atome Cα de la Glu conservée de l’hélice Cα et l’Asp du motif DFG.

D3est appelée la conformation αC-out dans l’état inactif et αC-in dans l’état actif195.

Figure 47: (a) La conformation active DFG-in de la kinase Fyn, ‘D1’ égale à 6.3 Å, ‘D2’ est de 10.7 Å et ‘D3’ égale à 8.2 Å. (b) La conformation inactive de la kinase Fyn avec une ‘D3’ de 9.9 Å.

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Il est bien clair dans la figure 47, l’analyse conformationnelle de la kinase Fyn en DFG-out révèle que la ‘D1’ égale à 6.3 Å et ‘D2’ est de 10.7 Å. La distance ‘D3’ était de9.9 Å au niveau de la conformation DFG-out et de 8.2 Å pour la conformation DFG-in.

Alors, la distance D1 est <7,2 Å, D2> 9 Å et 9 Å<D3<10,5 Å, ce qui confirme que le modèle prédit de la Fyn kinase en DFG-out est fiable. La structure téléchargée de Fyn kinase dans l'état DFG-in est vérifiée par le calcul D3. Il a été inférieur à 9 Å ce qui confirme leur état actif.