57 précurseurs et 0,5 Da pour les fragments. Le nombre maximal de clivages manqués est limité à 2 pour

la trypsine. Les modifications variables suivantes sont autorisées : l’oxydation (Met), la

phosphorylation (Ser, Thr, Tyr), l’acétylation (extrémité N-terminale de la protéine). La base de

données SwissProt (02/2017) avec la taxonomie Homo sapiens est utilisée pour l’étape d’identification

MS/MS. Les identifications de peptides sont validées en fixant un seuil de 1% False Discovery Rate

(FDR) calculé avec l’algorithme Percolator. Un test de Limma, effectué sur 6 (pour M2-1) ou 4 (pour L)

expériences indépendantes grâce au logiciel R, permet l’estimation du ratio d’abondance moyen (fold

change) de chaque protéine identifiée et teste l’écart entre ce fold change et 1. La p-value associée à

ce test est précisée. Les protéines sont considérées comme interacteurs potentiels si leur fold change

moyen est supérieur à 2 et leur p-value est inférieure à 0,05.

58

6 RESULTATS

6.1 Construction et caractérisation de virus recombinants

Plusieurs virus recombinants exprimant des protéines virales fluorescentes ont été obtenus par

génétique inverse. Nous avons décrit le protocole utilisé dans l’article de Bouillier et al. « Generation,

amplification and titration of recombinant respiratory syncytial viruses to monitor viral multiplication

and viral factories dynamics », actuellement en cours de publication dans le journal JoVE. Le génome

de ces virus est présenté dans la Figure 18 :

- Le RSV GFP présente un gène surnuméraire inséré entre P et M exprimant le fluorochrome

GFP. Il est flanqué des séquences promotrices et terminatrices virales GS et GE nécessaires à

sa transcription par la L. Sa construction est semblable à celle des virus recombinants RSV

Cherry et RSV Luc décrits par l’équipe dans un article antérieur (Rameix-Welti et al. 2014).

- Le RSV M2-1-GFP possède, en plus du gène M2 sauvage codant pour M2-1 et M2-2, un gène

surnuméraire codant pour M2-1 fusionnée à GFP à son extrémité C-terminale. Ce gène est lui

aussi flanqué par les séquences GS et GE. Nous avons fait le choix de dupliquer M2-1 plutôt

que d’accoler GFP à la 1 d’origine, afin de ne pas perturber l’expression de la protéine

M2-2. De plus, M2-1-GFP est introduite entre SH et G. Ainsi, si une recombinaison homologue

survient entre M2-1-GFP et M2-1, éliminant la GFP, les gènes G et F seront aussi supprimés.

Dans ces conditions, le virus résultant ne sera pas capable de produire des virions, empêchant

sa propagation.

- Le RSV L-GFP présente une séquence GFP insérée à l’intérieur du gène codant pour L, au niveau

de la région variable 2 de L, appelée « hinge 2 ». Cette région est déjà décrite comme pouvant

accueillir l’insertion d’une protéine fluorescente sans abolir le fonctionnement de la

polymérase virale (Fix et al. 2011).

59

Figure 18 : Virus recombinants produits par génétique inverse.

Le RSV GFP présente un gène surnuméraire codant pour le fluorochrome GFP, introduit dans le génome

viral entre P et M. Le RSV M2-1-GFP exprime, en plus de la M2-1 sauvage, une M2-1 chimérique

fusionnée à de la GFP, introduite entre SH et G. Le RSV L-GFP présente une L dans laquelle a été insérée

une séquence de GFP, au niveau d’une de ses régions variables.

La cinétique d’expression des protéines virales des RSV GFP et RSV M2-1-GFP a été comparée à celle

du RSV sauvage (WT). Des extraits protéiques ont été réalisés à différents temps post-infection sur des

cellules HEp-2 infectées par du RSV WT, du RSV GFP ou du RSV M2-1-GFP. L’infection a été réalisée à

forte multiplicité d’infection (MOI) afin de se placer en conditions de cycle unique. Les protéines virales

ont ensuite été visualisées par Western Blot, de même qu’une protéine cellulaire, PCNA, pour vérifier

la quantité de lysat cellulaire déposée (Figure 19A). Les 3 virus ont un profil d’expression similaire. Un

léger retard d’expression aux temps précoces de l’infection est observé pour les protéines P et M2-1

du RSV M2-1-GFP, mais cette différence s’estompe après 24 h p.i. Pour le RSV M2-1-GFP, l’expression

de la protéine chimérique M2-1-GFP est visible à partir de 24 h p.i.

Nous avons ensuite vérifié le pouvoir infectieux du RSV M2-1-GFP. Des cellules HEp-2 ont été infectées

par du RSV WT ou du RSV M2-1-GFP à forte MOI. Les virus ont été récoltés à 0, 8, 12, 16, 24 et 48 h p.i,

et leur titre a ensuite été déterminé par la méthode des plages de lyse (Figure 19B). Les deux virus

présentent des cinétiques identiques : la production de virions s’amorce entre 8 et 12 h p.i, s’intensifie

entre 12 et 16 h p.i et atteint ensuite un plafond. Le titre du RSV M2-1-GFP est toujours légèrement

plus faible que celui du RSV sauvage, mais cette différence n’est pas significative. La cinétique des titres

60

Figure 19 : Caractérisation des virus recombinants RSV GFP et RSV M2-1-GFP

A. Des cellules HEp-2 ont été infectées par du RSV sauvage, du RSV GFP ou du RSV M2-1-GFP, et des

extraits protéiques ont été récoltés à 0, 4, 8, 12, 16, 24, 34 et 48 h p.i. Après SDS-PAGE, les membranes

ont été incubés avec des anticorps dirigés contre les protéines virales N, M, P, M2-1 et la protéine

cellulaire PCNA. B. Des cellules HEp-2 ont été infectées par du RSV sauvage ou du RSV M2-1-GFP à forte

MOI, et les virus ont été récoltés à 0, 8, 12, 16, 24 et 48 h p.i. Leur titre a ensuite été déterminé par la

méthode des plages de lyse. Les données ont été récoltées sur 3 répétitions faites en triplicat. Un test

de Student a été réalisé sur les titres du RSV WT et du RSV M2-1-GFP à chaque temps post-infection.

Une différence statistiquement significative n’est observée que pour le temps 0 h p.i.

6.2 Identification de partenaires potentiels cellulaires de M2-1 et L

par un crible de leur interactome

Afin de mieux comprendre les interactions des protéines virales M2-1 et L au sein des cellules infectées,