La plupart des virus dont les ARNm comportent des sites internes d’entrée des ribosomes (IRES) ont une traduction indépendante de PABPC1, mais il existe quelques exceptions pour lesquels PABPC1

stimule la traduction, tel que le coxsackievirus B3 et le cytomegalovirus (Bradrick et al. 2007; McKinney,

Perez, and Mohr 2012). L’infection par le cytomegalovirus induit d’ailleurs une augmentation de

l’expression de PABPC1, mais le mécanisme impliqué n’est pas encore connu (Walsh et al. 2005). Pour

le coxsackievirus B3, cette stimulation de la traduction virale par PABPC1 peut paraître étonnante, car

ce virus code aussi pour une protéase qui clive PABPC1 (Kerekatte et al. 1999). Cependant, les résultats

de Bradrick et al. suggèrent que PABPC1 stimule mais n’est pas indispensable à la traduction du

coxsackievirus B3 : le clivage de PABPC1 pourrait ainsi permettre une régulation de sa propre

traduction en plus d’inhiber la traduction cellulaire. Alternativement, même si le clivage de PABPC1

diminue sa capacité à stimuler la traduction cellulaire (Kerekatte et al. 1999), il peut ne pas avoir d’effet

sur la capacité de PABPC1 à stimuler la traduction de ce virus.

De plus, un virus dont l’ARN génomique de polarité positive n’est pas polyadénylé, le virus de la

dengue, utilise PABPC1 pour sa traduction. La région 3’ UTR de cet ARN viral interagit avec de

nombreux facteurs cellulaires intervenant dans la traduction, dont PABPC1 (grâce à deux sites

fortement adénylés de cet UTR). Une étude suggère que PABPC1 contribue à la pseudo-circularisation

de cet ARN génomique viral, de la même façon que lors de la traduction cellulaire (Polacek, Friebe, and

Harris 2009).

Enfin, certains virus, comme le poxvirus et le RSV, relocalisent PABPC1 au niveau de structures de type

« usines virales » dans lesquelles se déroulent l’expression des protéines virales (Rincheval et al. 2017;

Walsh et al. 2008). Leur accumulation dans ces structures pourrait favoriser l’accès aux autres

composants du complexe d’initiation de la traduction et/ou aux ARNm viraux, favorisant ainsi

l’expression des protéines virales.

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4 OBJECTIFS

Le RSV représente un problème de santé publique majeur. Malgré cela, après 50 ans de recherche,

aucun vaccin ni traitement antiviral curatif contre ce pathogène n’a encore pu être développé. Les

interactions entre les protéines du RSV et les protéines cellulaires représentent des cibles d’intérêt

majeur pour la conception de molécules antivirales. De plus, de nombreux aspects du cycle viral du

RSV restent obscurs, et l’identification de partenaires cellulaires des protéines virales pourrait

participer à leur clarification. Cependant, l’interactome cellulaire des protéines du RSV a été jusqu’ici

très peu exploré.

C’est dans ce contexte que mon projet de thèse a été élaboré. Il s’inscrit au sein du projet ANR

RESPISYNCYCELL, qui regroupe des équipes françaises de l’INRA, de l’Université Versailles Saint

Quentin, du CNRS et de l’Institut Pasteur et des laboratoires brésiliens des Universités de São Paulo et

Campinas. Son objectif est d’identifier des interactions entre protéines virales et protéines cellulaires

et d’obtenir des données structurelles et fonctionnelles pour ces complexes in vitro et in cellula. Nous

avons choisi de nous concentrer sur l’interactome de deux protéines du virus respiratoire syncytial, la

polymérase L et le facteur de transcription M2-1. En effet, ces deux protéines sont essentielles à la

réplication du virus. De plus, aucun antiviral actuellement en développement ne cible M2-1, et seul

l’antiviral ALS-008176 cible L. Pour identifier des partenaires potentiels de ces deux protéines, nous

avons mis au point un crible discriminant à la fois sur des critères d’interactomique et fonctionnels.

Pour l’étape de criblage des interactions à proprement parler, une approche de

co-immunoprécipitation couplée à une analyse protéomique quantitative, déjà utilisée dans plusieurs

études, a été choisie. L’originalité de notre méthode repose sur l’utilisation de virus recombinants afin

de réaliser les co-immunoprécipitations en condition d’infection et non d’expression provisoire des

protéines virales. Ceci devrait permettre l’identification d’interactions plus pertinentes. La 2e étape de

notre approche, le crible fonctionnel, repose sur l’utilisation de siRNA pour inhiber l’expression des

différents candidats et mesurer l’impact de cette inhibition sur la multiplication virale. A l’issue de ce

crible, l’objectif était d’obtenir un ou plusieurs candidats interagissant avec L ou M2-1 et ayant de

l’importance pour la réplication virale. Une étude approfondie de ce ou ces candidats permettrait

ensuite l’obtention de données structurelles et fonctionnelles supplémentaires.

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5 MATERIEL ET METHODES

5.1 Matériel

5.1.1 Cellules

Les cellules HEp-2 sont des cellules épithéliales humaines dérivées d’un carcinome du col utérin. Les

cellules BSR-T7 sont dérivées de la lignée BHK-21, des cellules épithéliales de rein de hamster, et ont

été modifiées génétiquement afin d’exprimer de manière constitutive l’ARN polymérase du

bactériophage T7. Les cellules A549 sont des cellules épithéliales alvéolaires humaines dérivées d’un

carcinome pulmonaire. Les cellules HEK-293T sont dérivées de la lignée HEK-293, des cellules de rein

embryonnaire humain, et ont été modifiées génétiquement afin d’exprimer de manière constitutive

l’allèle tsA1609 de l’antigène T du SV40.

Ces lignées sont cultivées en milieu de culture Minimum Essential Media (MEM, Gibco)(pour les

HEp-2) ou Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco)(pour les BSR-T7, A549 et HEK-293T)

contenant 2 mM de L-alanyl-L-glutamine, et supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF), 100

U/mL de pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine à 37°C, dans une atmosphère humide contenant

5% de CO2. Les cellules sont entretenues par passage régulier 2 fois par semaine. Après rinçage au

Phosphate Buffered Saline (PBS, Gibco), les cellules sont incubées en trypsine - Éthylène Diamine

Tétra-Acétique (EDTA) 0,05% (Gibco) à 37°C pendant 5 min, reprises dans du milieu et comptées sur une

lame de Malassez. Les cellules sont ensuite mises en culture sur les supports appropriés et incubées à

37°C, 5% de CO2.

5.1.2 Virus

Les virus recombinants RSV GFP, RSV M2-1-GFP, RSV L-GFP et RSV P-BFP ont été produits dans notre

équipe par génétique inverse. Les virus sont amplifiés à multiplicité d’infection (MOI) d’environ 0,05

PFU/cellule sur cellules HEp-2 à 37°C et récoltés à 72 ou 96 h p.i. Les stocks de virus recombinants

utilisés pour les expériences ont été passés 2 à 4 fois (un passage consiste en une infection sur cellules

HEp-2 à 37°C pendant 72 h suivie d’une récolte de la suspension virale).

5.1.3 Anticorps

Les anticorps primaires anti-N, anti-P, anti-M et anti-M2-1 utilisés sont polyclonaux et ont été produits

par l’INRA de Jouy-en-Josas par immunisation d’un lapin avec de la protéine N, P, M ou M2-1

recombinante. L’anticorps anti-N a été utilisé au 1/2000e lors des marquages par immunofluorescence.

Pour les Western blot, l’anticorps anti-N a été dilué au 1/50000e, l’anticorps anti-M au 1/5000e,

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