PARTIE I- ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I.3. Préconcentration par amplification du champ électrique
I.3.5. Préconcentration par isotachophorèse capillaire
L‟isotachophorèse capillaire (ITP) est un mode de séparation dans lequel les analytes chargés sont séparés dans un gradient discontinu de champ électrique en zones successives rangées selon leurs mobilités décroissantes. Les travaux effectués au cours de cette thèse nécessitent d‟en rappeler certains de ses aspects. Pour une information plus complète, le lecteur pourra se référer à différentes revues [17,18,115,116].
Dans une configuration sans EOF, l‟échantillon est injecté hydrodynamiquement dans le capillaire entre un électrolyte meneur (EM), placé dans le capillaire et dans le réservoir de sortie, et un électrolyte terminal (ET), placé dans le réservoir d‟entrée. L‟EM et l‟ET contiennent des ions de même signe que les analytes d‟intérêt présents dans l‟échantillon, ayant des mobilités supérieures et inférieures, respectivement, à celles des analytes. Lors de l‟application d‟une tension, les ions se séparent selon leur différence de mobilité entre l‟EM et l‟ET. Du fait de la discontinuité en mobilité et concentration des ions introduits dans le milieu de séparation, un gradient discontinu du champ électrique est créé entre ces différentes bandes, et le champ électrique régnant dans chaque bande est inversement proportionnel à la mobilité de l‟analyte (condition d‟isotachophorèse). Ce sont les ions de chaque bande qui assurent la conduction électrique et non un électrolyte unique comme en CZE. Ainsi, un ion rapide diffusant dans la zone d‟un ion lent est soumis à un champ électrique plus élevé et est donc accéléré pour rejoindre sa propre bande où règne un champ plus faible, ce qui entraine un contrôle de la dispersion des bandes par électromigration. Conformément à la KRF, les
34 concentrations dans chaque bande d‟analyte sont ajustées à celle de l‟ion meneur et dépendent aussi du contre-ion C, conformément à l‟équation suivante :
) ( ) ( Q A M C M A M A µ µ µ µ µ µ C C (10)
où CA et CM représentent les concentrations de l‟analyte (A) et de l‟ion meneur dans leur zone respective, µA, µM et µC les mobilités absolues (valeurs absolues) de l‟analyte, de l‟ion meneur et du contre ion C supposé le même pour A et EM [117,118].
Cette équation montre que la concentration de l‟analyte A est fonction de la concentration de l‟ion meneur. Ainsi, l‟ITP peut être utilisée comme méthode de préconcentration. Ceci a été montré pour la première fois par Foret et coll. qui ont utilisé une approche avec deux capillaires couplés (le premier pour la préconcentration par ITP et le deuxième pour la séparation en mode zone) afin d‟analyser de la thiamine dans du sang humain avec des facteurs d‟enrichissement de 200 [119]. Depuis lors, cette méthode a été utilisée pour de nombreux composés dans de nombreuses matrices et les gains en sensibilité peuvent aller jusqu‟à 10 000 [120]. Toutefois, l‟application de cette approche demande une modification d‟appareillage qui n‟est pas disponible commercialement et donc nous ne nous n‟attarderons pas dessus.
La deuxième possibilité développée est l‟isotachophorèse capillaire en régime transitoire (t-ITP), dont le principe est représenté dans la Figure I-4 pour une configuration sans EOF et telle que le co-ion de l‟électrolyte joue le rôle d‟ion terminal [118,121,122]. Le capillaire est tout d‟abord conditionné par l‟électrolyte, puis sont introduites successivement une zone contenant l‟ion meneur (IM) et l‟échantillon (a). Lors de la mise sous tension un gradient de champ électrique est créé et les concentrations des analytes sont ajustées selon le principe d‟ITP. De plus, une zone de transition commence à être formée à l‟avant de la frontière entre l‟ion meneur et l‟électrolyte de séparation ; l‟ion meneur pénètre l‟électrolyte et son front avant s‟élargit (b). Simultanément, l‟électrolyte pénètre dans les différentes zones (analytes et meneur) et les conditions d‟ITP sont rompues au fur et à mesure pour les différents analytes par ordre croissant de leur mobilité (c). Enfin, la séparation des analytes se poursuit en mode zone (d).
35 Figure I-4 : Schéma de préconcentration par t-ITP dans le cas où le co-ion du BGE joue le rôle d‟ion terminal et l‟EOF est nul. (a) Conditionnement du capillaire par l‟électrolyte, l‟ion meneur (IM) puis l‟échantillon (EC). (b) Application de la tension et création d‟un gradient de champ électrique : la concentration des analytes classés selon leur mobilité est ajustée sur celle de l‟ion meneur. (c) Rupture des conditions d‟ITP en commençant par l‟ion avec la plus petite mobilité. (d) Ruptures des conditions d‟ITP pour toutes les zones et séparation en CZE. Ec : abréviation pour échantillon.
Le mécanisme présenté laisse donc apparaître une étape d‟ajustement des concentrations des analytes par ITP qui s‟effectue de manière transitoire. La cinétique de ce phénomène a été bien décrite dans la littérature selon les différents cas de figures envisageables grâce à des simulations et vérifications expérimentales [123,124,125]. Enfin, comme il y a préconcentration, les volumes d‟échantillon injectés sont plus élevés qu‟en CE classique, ce qui augmente la sensibilité. Il est important de souligner que les mobilités et les concentrations des différents ions ainsi que les longueurs des zones de meneur et de terminal sont les facteurs prépondérants.
36 Le cas de t-ITP présenté ci-dessus est un exemple de configuration particulière. En effet, il en existe plusieurs, car les ions meneurs et terminaux peuvent être présents en même temps ou séparément dans l‟électrolyte, en tant que zone ajoutée, ou encore dans l‟échantillon [126]. Dans le cas où l‟ion terminal ou meneur est présent dans l‟échantillon, le terme de « sample self stacking » a été introduit [117,127,128]. Il faut pour cela que des conditions bien particulières de mobilité et de concentration des ions meneurs et terminaux soient respectées. Ce cas de figure est particulièrement intéressant pour la préconcentration par t-ITP d‟échantillons contenants des teneurs élevées en ions très mobiles tels que les échantillons urinaires et sanguins. En effet, les ions chlorure et sodium jouent souvent le rôle d‟ion meneur ; dès lors, cette méthode est applicable aux échantillons de forte conductivité, sans qu‟une préparation d‟échantillon (dessalage) ne soit nécessaire (à la différence de la FASS et FESI) ce qui fait que cette méthode a été très utilisée avec des gains en sensibilité allant jusqu‟à plusieurs centaines [129-132].