Étude 1
Population à l'étude
Les sujets de cette étude, portant initialement sur les effets des substances toxiques organochlorées et le risque de cancer du sein, ont été recrutés entre les mois d'octobre 1994 et mars 1997 dans quatre hôpitaux de la ville de Québec (129). Toutes les participantes devaient être résidantes de la région métropolitaine de Québec et avoir entre 30 et 70 ans. Les cas sont constitués de 315 femmes ayant un nouveau diagnostique de cancer du sein infiltrant, histologiquement confirmé. Un premier groupe de 219 témoins hospitaliers provenant des quatre même hôpitaux, de même qu'un second groupe de 307 témoins tiré au hasard de la population de la région de Québec à partir du fichier de la Régie de l'assurance maladie du Québec ont été recrutés. Les cas et les témoins ont été appariés pour l'âge (par classes de 5 ans) et pour le type de milieu résidentiel (rural/urbain). Les critères d'exclusion s'appliquant aux cas comprenaient toute histoire antérieure de cancer du sein de même que la présence de métastases à distance au diagnostic. Les témoins et les cas devaient également être exempts de toutes autres formes de cancer à l'exception du cancer in situ du col de l'utérus ou du cancer de la peau basocellulaire. De plus les témoins hospitaliers devaient être exempts de toutes maladies gynécologiques; ils étaient admis pour subir des chirurgies digestives (50%), orthopédiques (25%), vasculaires (14%), et autres (11%). Le taux de participation fut de 91% chez les cas, 89% chez les témoins hospitaliers et 47 % chez les témoins de population.
Collectes de données
Échantillons et questionnaires: Les échantillons de sang ont été prélevés chez les cas et les témoins hospitaliers après la chirurgie, et pour les cas préalablement à toute chimiothérapie ou radiothérapie. Les témoins de population ont été visités à la maison par une infirmière de recherche et la prise de sang fut effectuée à cette occasion. Enfin toutes les informations des participantes touchant les caractéristiques démographiques, anthropométriques, l'histoire reproductive et les habitudes de vie, ont été obtenues par entrevue téléphonique.
Mesures des polymorphismes: Les polymorphismes génétiques Bsml et Fokl affectant le gène du récepteur à la vitamine D (VDR) ont été analysés au centre de recherche du pavillon Saint-François-d'Assise du Centre hospitalier universitaire de Québec (CHUQ), dans le laboratoire du Docteur François Rousseau. L'ADN a été extrait à partir des échantillons de sang en utilisant les réactifs et la procédure Qiagen pour plaque à 96 puits (Qiagen inc. Mississauga, Canada). L'amplification des séquences géniques du VDR à l'aide de la réaction de polymerase en chaîne (PCR) suivie d'une digestion par les enzymes de restriction Bsml et Fokl ont permis la détermination des génotypes associés à ces deux polymorphismes. L'absence de site polymorphique pour Bsml (B) résulte en un fragment de 850 pb alors que sa présence (b) résulte en un fragment de 700 et un de 150 pb (130). Dans le cas de Fokl l'absence de site polymorphique (F) résulte en un fragment de 265 pb et sa présence (f) en fragments de 196 et de 69 pb (131). L'interprétation des résultats du génotypage de chacun des deux polymorphismes du VDR a été réalisée à l'insu du statut de cas ou de témoin, par trois lecteurs indépendants. En l'absence de concordance de 100% entre les trois lecteurs, l'amplification et la digestion étaient reprises, et les génotypes réassignés indépendamment. Compte tenu de la non-disponibilité de l'ADN pour certains sujets, du taux de succès imparfait du PCR et du manque de concordance, 688 (242 cas, 446 témoins) participantes ont été génotypées pour Bsml et 679 (248 cas, 431 témoins) pour Fokl.
Étude 2
Population à l'étude
Pour cette étude, 622 participantes servant de cas ont été recrutées du mois de septembre 1999 à novembre 2001 au Centre des maladies du sein Deschênes-Fabia du Centre hospitalier affilié universitaire de Québec. Seul les cas ayant reçu un premier diagnostic de cancer du sein confirmé histologiquement par une évaluation pathologique, à l'exclusion d'un diagnostic de néoplasie lobulaire, étaient admis à l'étude. Les cas ont été appariés pour
l'âge (par classes de 5 ans) et la région de résidence avec 974 témoins répondant à une sollicitation publiée dans un journal local et grâce à une campagne de prévention des facteurs de risque des maladies cardiovasculaires et de l'ostéoporose ayant lieu dans divers lieux publics, centres d'hébergement ou milieux de travail. La grande majorité des participantes, cas et témoins, étaient résidentes de la région de Québec, tout comme celles de la 1èr6 étude.
Collectes de données
Échantillons et questionnaires: Les échantillons de sang de même que toutes les informations touchant les caractéristiques démographiques, anthropométriques, l'histoire reproductive et les habitudes de vie, ont été obtenues chez les cas lors d'un suivi post chirurgie et avant toute chimiothérapie ou radiothérapie. Pour les témoins ces renseignements, couvrant également les facteurs de risques de cancer du sein, ont été acquis lors du recrutement grâce à un questionnaire harmonisé entre les groupes de cas et de témoins.
Mesures des polymorphismes: Tout comme dans l'étude 1, les polymorphismes génétiques Bsml et Fokl du récepteur à la vitamine D ont été analysés au centre de recherche du pavillon Saint-François-d'Assise du Centre hospitalier universitaire de Québec (CHUQ), dans le laboratoire du Docteur François Rousseau. L'ADN a été extrait à partir d'échantillons sanguins de 200 uL en utilisant les réactifs et la procédure Qiagen pour plaque à 96 puits (QIAamp blood lcit de Qiagen inc. Mississauga, Canada). L'ADN obtenu a été dilué cinq fois avec une solution 10 uM TRIS-HCL à pH de 7.5 et contenant 33.7 uM d'une teinture fluorescente inerte, ROX (Molecular Probes, Invitrogen). Les SNP ont été analysés par réaction de polymerase en chaîne spécifique à chaque allele (allele-specific PCR). Les résultats du génotypage ont été définis à l'aide d'un logiciel développé par le laboratoire qui détermine directement le génotype (allele normal ou muté) selon les mesures de fluorescence associées à chaque réaction spécifique. Tout résultat ambigu était repris par PCR jusqu'à l'obtention d'un résultat concluant. Les génotypes étaient automatiquement associés à l'ADN des participantes à l'aide de deux codes à barre (un par allele) minimisant ainsi les possibilités d'erreurs. Jusqu'à présent cette méthode a démontré une reproductibilité moyenne de 99.7% et un taux moyen de rejet inférieur à 1% lors d'analyses en duplicata de 5000 génotypes provenant de 15 différents SNP. Dans cette étude cas-témoins 1584 et 1585 participantes ont été génotypées pour Bsml et Fokl respectivement.
Étude 3
Population à l'étude
Dans le cas de cette dernière étude portant sur la densité mammaire, on a recruté des femmes ayant eu une mammographie entre février 2001 et mars 2002 à la Clinique radiologique Audet, l'une des cliniques où il se fait le plus de mammographies au Québec. Pour être admissibles à l'étude, les femmes devaient être venues à la clinique pour une mammographie de dépistage soit dans le cadre du Programme québécois de dépistage du cancer du sein (PQDCS), pour une mammographie de routine en l'absence ou en présence d'un problème au sein bénin, connu et stable, ou pour une mammographie périodique motivée par une histoire familiale de cancer du sein. De plus, les femmes ne devaient pas avoir pris de contraceptifs hormonaux ou d'hormones de substitution au cours des derniers 3 mois, ne jamais avoir pris de tamoxifène, ne pas participer ou avoir participé aux études NSABP et STAR sur la prévention du cancer du sein (impliquant l'utilsation de tamoxifène ou de raloxifene). Elles ne devaient pas être enceintes, porter ou avoir porté des implants mammaires et ne jamais avoir eu un cancer du sein ou tout autre type de cancer, ni souffrir de l'une des conditions suivantes: diabète, maladie du foie, maladie de la glande thyroïde ou maladie des glandes surrénales.
Le statut ménopausique des femmes admissibles était défini à l'aide des critères du « Nurses' Health Study » (132) dans le but de recruter séparément des femmes pré- et post- ménopausées.
Collectes de données
Échantillons et questionnaires: Les échantillons de sang des participantes de même que les informations touchant leurs caractéristiques anthropométriques ont été recueillis sur place lors de la mammographie. Le sang prélevé et conservé sur glace a été rapidement acheminé au laboratoire où il a été centrifugé, aliquoté et congelé jusqu'au moment des analyses de 25(OH)D ou de génotypage. Un questionnaire alimentaire auto-administré, une version traduite en français du « Willett Food Frequency Questionnaire (FFQ) » démontré fiable et valide (133), et visant à décrire les habitudes alimentaires durant la dernière année, a été complété par chacune des participantes. De plus, les participantes devaient documenter la dose quotidienne ou hebdomadaire de leurs apports en suppléments vitaminiques et minéraux. La moyenne des apports quotidiens d'un vaste ensemble de nutriments a par la
suite été calculée à partir des aliments consommés et des suppléments utilisés par chaque participante au Channing Laboratory de l'université Harvard, là où le questionnaire a été mis au point.
Les autres informations touchant les facteurs de risque de cancer du sein, incluant les caractéristiques démographiques, l'histoire reproductive et les habitudes de vie, ont été obtenues à la suite d'entrevues téléphoniques réalisées rapidement après la mammographie. Ces entrevues comprenaient également un questionnaire concernant l'activité physique, tiré du « Nurses' Health Study II Activity and Inactivity Questionnaire » (134).
Mesures de la densité mammaire: Plusieurs facteurs ont contribué à l'obtention de mesures de la densité mammaire de haute qualité dans cette étude. Tout d'abord les mammographies provenaient toutes de la même clinique certifiée par le PQDCS et à la fine pointe de la technologie rendant ainsi les films plus comparables. Ensuite ces films mammographiques ont été numérisés par une seule personne à l'aide d'un appareil « Lumiscan85 digitizer » ayant une excellente résolution et calibré à chacune des séances de numérisation. Les mesures du pourcentage de densités mammaires ont été obtenues en choisissant aléatoirement une des deux images craniocaudales et effectuées à l'aveugle par une seule personne formée à cet effet. Le programme de contrôle de qualité avec insertion de plusieurs images répétées (20%), incluant des duplicata, dans tous les lots de numérisation, a permis d'obtenir une excellente reproductibilité avec un coefficient de corrélation intraclasse de 0.98 et un coefficient de variation de 4% respectivement.
Mesures des polymorphismes: Compte tenu des résultats déjà obtenus par notre groupe dans cette population, et montrant une association inverse entre les apports en vitamine D (6) ou les niveaux sanguins de 25(OH)D (7) et la densité mammaire parmi les femmes préménopausées, la mesure des polymorphismes sur la voie de signalisation de la vitamine D a été limitée à ces dernières. Tous les polymorphismes ont été analysés au Centre d'innovation Génome Québec et Université McGill sur la nouvelle plateforme Sequenom (Sequenom MassArray, San Diego, Inc.). Des comparaisons avec d'autres plateformes ont été réalisées sur 10% des échantillons, elles ont donné une concordance de plus de 99%, démontrant ainsi la validité de la nouvelle méthode. L'ADN a été extrait à partir des échantillons de sang en utilisant les réactifs et la procédure recommandés par le manufacturier (PUREGene DNA extraction kit, Gentra Inc., Minneapolis, MN, USA). Chacune des plaques à 96 puits contenait un contrôle négatif (sans ADN) et un contrôle positif pour s'assurer de la précision du génotypage. Parmi les 741 femmes
préménopausées pour lesquelles de l'ADN était disponible, le taux de succès du génotypage de tous les SNP a été supérieur à 99% sauf pour un polymorphisme du VDR (rs7975232 = 95.4%), ce qui ce traduit par des effectifs variant entre 707 et 739 selon les SNP.
Mesures de la 25-hydroxyvitamine D : Le sang des participantes, prélevé lors du recrutement, a été conservé à -80°C jusqu'à ce que les analyses de 25(OH)D soient réalisées entre les mois de novembre 2005 et janvier 2006 au laboratoire du docteur E. Delvin de l'Hôpital Sainte-Justine de Montréal. Ce laboratoire a participé à un programme international de contrôle de qualité des mesures de 25(OH)D et a atteint les cibles de performance définis par le DEQAS (25-hydroxyvitamin D External Quality Assessment Scheme) en 2004-2005. Les niveaux de 25(OH)D ont été obtenus par radio-immunoessais suivant une extraction à l'acétonitrile (DiaSorin Inc, Stillwater, MN). Les coefficients de variation intra-lot et inter-lots, basés sur quatre réplicats en moyenne pour chacun des 24 lots, étaient de 7.3 % et de 8.8 % respectivement démontrant ainsi la bonne qualité de nos données.