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Os factores genéticos relacionados com infertilidade são alterações cromossómicas, alterações monogénicas e deleções submicroscópicas do cromossoma Y (Griffin and Finch, 2005, Jonge and Barratt, 2006, Poongothai et al., 2009).

Alterações cromossómicas

As anomalias cromossómicas são uma das mais importantes causas de infertilidade. A incidência varia entre 2 e 8% com uma média de 5% (Foresta et al., 2002). Estas podem ser somáticas ou ligadas aos cromossomas sexuais, podem ser estruturais ou numéricas (Griffin and Finch, 2005, Martin, 2008, Poongothai et al., 2009). As anomalias estruturais incluem inversões (paracêntricas ou pericêntricas) e translocações equilibradas (Robertsonianas, reciprocas, dos autossomas ou dos cromossomas sexuais). As alterações numéricas incluem trissomias constitucionais como Síndrome de Down (trissomia 21) e as trissomias dos cromossomas sexuais (Síndrome de Klinefelter (XXY) ou Síndrome de Jacobs (XYY)). Um outro tipo de alteração numérica é aquela confinada aos espermatozóides (Griffin and Finch, 2005).

As alterações estruturais mais frequentes são as translocações Robertsonianas, estas em homens inférteis apresentam uma incidência de 0,7%, ou seja, 8,5 vezes superior à encontrada na população masculina em geral (Van Assche et al., 1996). Destas as mais comuns são entre os cromossomas 13-14 e 14-21, sendo que raramente estas afectam o fenótipo do indivíduo, mas que normalmente afectam a fertilidade devido a uma gametogénese errada ou devido a um rearranjo parental não equilibrado, estes problemas têm diferentes níveis e estão directamente

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ligados ao distúrbio no processo meiótico (Ferlin et al., 2007). Van Assche e colaboradores, 1996, concluíram que também as translocações recíprocas têm um peso mensurável sendo que têm uma incidência de 0,5% dos homens com infertilidade e de apenas 0,1% na população masculina em geral (Van Assche et al., 1996). Aparentemente estas também não afectam, normalmente, o fenótipo do portador, mas a evidência tem demostrado que alteram o processo espermatogénico (Ferlin et al., 2007).

Das alterações numéricas a mais frequente é o Síndrome de Klinefelter, esta é também a mais frequente de todas as anomalias cromossómicas nos casos de infertilidade, sendo que se encontra em aproximadamente em 5% dos homens com oligozoospermia severa e em 10% dos casos dos homens com azoospermia em contraponto com os 0,1-0,2% da população masculina em geral (Foresta et al., 2005). O cromossoma X extra pode ser originado de uma não disjunção de XY na meiose I paterna (em aproximadamente 50% dos casos), através da meiose materna I ou II (cerca de 40%) e os restantes serem pós zigóticos (Hirsh et al., 1996). Nos indivíduos XXY a espermatogénese pára no espermatócito primário mas, ocasionalmente, fases mais tardias podem ser observadas (O'Flynn O'Brien et al., 2010). Estes indivíduos podem tentar técnicas de fertilização in vitro, mas existe o risco da sua prole apresentar também anomalias cromossómicas, este medo foi consubstanciado por diversos estudos que mostravam que os indivíduos que padeciam da síndrome tinham vários gâmetas aneuplóides (Georgiou et al., 2006). Isto acontece quando a segregação anormal escapa aos checkpoints meióticos (Hassold et al., 1992).

Um espermatozóide normal tem 23 cromossomas, sendo que é monossómico para todos os autossomas e tem apenas um X ou um Y. Os espermatozóides anormais podem ser nulissómicos, em que um cromossoma é perdido; dissómico, tem um par de cromossomas; ou mesmo diplóide, em que todos os cromossomas estão em duplicado apresentando 46 cromossomas (Jamar et al., 2000). Na revisão feita por Martin em 2008 este encontrou uma taxa de aneuploidia para os cromossomas sexuais que variava entre 0,3 e 15% (Martin, 2008), valores bem diferentes dos que Gordeeva et al., 2011, apresentava no que concerne a homens sem patologia (1-2% de aneuploidias) (Gordeeva et al., 2011).

Alterações monogénicas

São poucos os genes não ligados ao cromossoma Y identificados como passíveis de alterarem a fertilidade mas temos alguns exemplos bem descritos como caso do locus da fibrose cística (gene CFTR) presente no braço longo do cromossoma 7, isto porque alterações neste gene são encontradas em 60-90% dos doentes com aplasia bilateral congénita dos canais deferentes

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(CBAVD) o que leva a azoospermia obstrutiva (Georgiou et al., 2006, Jonge and Barratt, 2006, Ferlin et al., 2007).

Também o gene da globulina ligadora às hormonas sexuais (SHBG), localizado no cromossoma 17 tem sido estudado por poder ter influência na espermatogénese, sendo que este tem influência no transporte das hormonas sexuais controlando a concentração dos androgénios (O'Flynn O'Brien et al., 2010).

Temos também distúrbios ligados ao cromossoma X como o syndrome Kallmann (o mais frequente) em que existe uma mutação no gene Kal-1 no braço curto do cromossoma X e que se caracteriza por uma associação entre hipogonadismo hipogonadotrófico e anosmia (Jonge and Barratt, 2006).

Existem outras síndromes de base genética que afectam a fertilidade como síndrome de Noonan, distrofia miotónica, hemoglobinopatias, síndrome de Prader-Willi ou a doença de Kennedy. Mas segundo Raheem et al., num trabalho recente (2012), a influência genética poderá ser muito maior com diversos genes responsáveis pela regulação da produção de espermatozóides, produção hormonal e receptores hormonais, que ainda não foram identificados, a serem a causa da infertilidade idiopática (Abdel Raheem et al., 2012).

Deleções submicroscópicas do cromossoma Y

O cromossoma Y é o mais implicado nos casos de infertilidade masculina. O gene SRY e um gene com ele relacionado, Sox9, levam à diferenciação das células de Sertoli na gónada bivalente, e à formação dos testículos (Kashimada and Koopman, 2010). Mutações nestes genes levam, respectivamente, a disgenesia gonadal e a displasia campomélica (Hanley et al., 2000).

Além do gene SRY, o cromossoma Y tem também uma região chamada de male-specific Y (MSY) cujos genes são indispensáveis à espermatogénese. Assim se parte do material se perder durante a mitose ou meiose, e como esta região não tem uma contraparte de material, pode haver alteração na espermatogénese (Abdel Raheem et al., 2012).

As regiões tipicamente envolvidas na infertilidade foram chamadas de factor de azoospermia ou AZF (onde se encontram AZFa, AZFb, AZFc e AZFd), localizam-se na região Yq11.23 e controlam a espermatogénese (Griffin and Finch, 2005, Navarro-Costa et al., 2010). Microdeleções (não se conseguem observar na citogenética convencional) nesta região são a mais importante causa de oligozoospermia severa e azoospermia não obstrutiva (Ferlin et al., 2007).

As deleções críticas podem-se dar em três regiões distintas AZFa, AZFb e AZFc. Deleções na região AZFa têm sido associadas à ausência de células germinativas ou síndrome das células de Sertoli; AZFb tem sido implicada na paragem da espermatogénese; já as deleções ao nível de AZFc

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originam uma maturação anormal dos espermatozóides (Navarro-Costa et al., 2010). Destas deleções as mais frequentes são as deleções em AZFc (cerca de 60% do total) seguidas das deleções em AZFb sozinhas ou com outras regiões AFZ (35% do total) e finalmente as deleções em AZFa (cerca de 5% do total) (Krausz et al., 2003).

Dano no DNA dos Espermatozóides

Durante a espermatogénese o núcleo dos espermatozóides sofre inúmeras alterações para que este fique num estado tipo cristalino e fique bioquimicamente inacessível. Esta inacessibilidade serve para que a informação genética fique protegida de factores ambientais como o stresse oxidativo ou alterações de pH no tracto genital masculino ou feminino (Ward, 2010).

O dano no DNA dos espermatozóides tem sido associado a alterações morfológicas (Nicopoullos et al., 2008), baixos níveis de implantação, elevada incidência de abortos, elevados níveis de morbilidade nos recém-nascidos e fertilidade diminuída quer in vivo como in vitro (Benchaib et al., 2007, De Iuliis et al., 2009, Ghazi and Abdelfattah, 2011).

Os factores responsáveis pela indução do dano no DNA continuam por ser descobertos, mas parecem existir tanto estímulos extrínsecos como factores físicos (como o calor e a radiação electromagnética), anomalias no metabolismo lipídico, leucócitos e idade; como intrínsecos, apoptose ou produção de radicais livres pelos espermatozóides (Benchaib et al., 2007, De Iuliis et al., 2009).

Aitken et al. em 2009 propôs um modelo passível de explicar os eventos que levariam ao dano no DNA, em que durante a espermatogénese acontecem erros na remodelação da cromatina que levam à produção de espermatozóides com o DNA nuclear pobre em protaminas, o que confere à célula um estado de susceptibilidade a ataques de ROS (Aitken et al., 2009).

Apesar de existirem vários estudos que demonstram a presença de DNA fragmentado em espermatozóides maduros, continua a não ser consensual se se tratam de células apoptóticas residuais que por alguma razão conseguiram chegar até ao evento ejaculatório, ou se se trata de apoptose tardia que ocorre já no espermatozóide maturo, ou ainda se esta fragmentação de DNA ocorre por um outro mecanismo (Evenson and Wixon, 2006). Para a detecção da fragmentação de DNA, têm vindo a ser usados diferentes ensaios como, dispersão de cromatina, estrutura da cromatina do espermatozóide (SCSA), ensaios cometa e método de adição de nucleótidos marcados com fluoresceína mediada pela enzima deoxinucleotidil transferase terminal (TUNEL) (Evenson et al., 2007, Lewis et al., 2008, Mitchell et al., 2011).

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O ensaio de TUNEL é um ensaio que foi desenvolvido para células somáticas, vindo mais tarde a ser adaptado para células espermáticas (Sailer et al., 1995). Este ensaio detecta fragmentações de DNA de cadeia simples e dupla, medida por um ponto terminal específico caracterizado pela presença de grupos hidroxilo livres 3’ (Sharma et al., 2010). O princípio deste ensaio assenta na transferência de um nucleótido marcado para o grupo 3OOH da cadeia de DNA fragmentado pela acção da enzima deoxinucleotidil transferase. Isto permite-nos definir se aquela célula apresenta ou não fragmentação do seu DNA (Evenson and Wixon, 2006).

Um defeito desta técnica é que ela depende da actividade da transferase terminal em aceder às quebras nas cadeias de DNA e catalisar a inserção das bases marcadas. E, se isto não é um problema nas células somáticas pode-o ser para os espermatozóides, visto estes serem extremamente especializados e terem uma cromatina altamente compacta que restringe este acesso (Mitchell et al., 2011).

O ensaio de cometa ou single cell gel electrophoresis (SCGE) é uma técnica em que os espermatozóides são suspensos em agarose de baixo ponto de fusão, em estado líquido, e posteriormente colocada numa lâmina de microscópio onde o gel solidifica. As células são lisadas e posteriormente sujeitas a electroforese horizontal (Evenson and Wixon, 2006). Esta técnica permite-nos (a pH> 12,6) detectar, em células individuais, rupturas em cadeias de DNA duplas e simples, sítios alquali-lábeis e ligações cruzadas (Collins, 2004, Kumaravel and Jha, 2006). Considera-se uma técnica sensível e rápida (Collins, 2004).

O DNA não fragmentado e com maior peso molecular permanece compacto enquanto as restantes partes, referidas anteriormente, migram formando uma espécie de cauda, daí o nome de cometa. Apesar dos diferentes protocolos utilizados a técnica tem passos comuns como preparação da suspensão, colocação no gel, lise celular, electroforese, neutralização, marcação e análise. A grande diferença dos protocolos para os espermatozóides e as células somáticas assenta na lise celular e descondensação do DNA, que como já foi referido é mais difícil nos espermatozóides. Então, torna-se necessária a incubação dos espermatozóides com proteínase K e detergentes (Shen et al., 1999).

É possível ainda detectar danos oxidativos pela incubação, após as lises celulares, com a enzima formamido pirimidina DNA glicosilase (FPG), que detecta guaninas 8-OH e outras purinas danificadas oxidativamente; quando incubado com FPG o ensaio torna-se mais sensíveis ao dano por alquilação que o ensaio de cometa convencional (Speit et al., 2004). Os danos oxidativos são determinados pela diferença de resultados entre o ensaio com incubação com a enzima FPG e o o ensaio sem incubação com a enzima FPG.

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Espécies reactivas de oxigénio (ROS) e stresse oxidativo

Os ROS são radicais livres e peróxidos que derivam do metabolismo do oxigénio e estão presentes em todos os organismos aeróbicos (Agarwal and Prabakaran, 2005). Eles são altamente instáveis e podem reagir com inúmeras substâncias como lípidos, aminoácidos, hidratos de carbono, proteínas ou DNA (Venkatesh et al., 2009). Elevados níveis de ROS são encontrados em 25-40% de homens inférteis (Linschooten et al., 2011).

Os três grandes tipos de ROS são o radical superóxido (02•-), que é formado quando existe

uma fuga da cadeia de transporte de electrões; o peróxido de hidrogénio (H2O2), que resulta da

dismutação de superóxidos ou pode ser gerado pela acção de algumas enzimas; e o radical hidroxilo (OH•), é formado a partir do peróxido de hidrogénio numa reacção catalisada por iões metálicos (Fe++ ou Cu+), é altamente reactivo e pode levar à modificação de purinas em pirimidinas e provocar quebras nas cadeias de DNA (Agarwal et al., 2005). Pode também levar à peroxidação de ácidos gordos polinsaturados (PUFA) e membranas celulares (peroxidação lipídica) (Lanzafame et al., 2009). Destes, o mais produzido pelos espermatozóides parece ser o radical superóxido, que pode gerar peróxido de hidrogénio pela acção da superóxido dismutase (SOD) ou espontaneamente (Lanzafame et al., 2009). O peróxido de hidrogénio parece estar intimamente associado à perda de motilidade pelos espermatozóides (Aitken and Baker, 2006).

Os ROS existentes no plasma seminal provêm essencialmente de leucócitos e de espermatozóides imaturos e morfologicamente anormais (Agarwal and Prabakaran, 2005, Makker et al., 2009).

Dependendo da concentração, localização e tempo de exposição, os ROS podem ter efeitos benéficos ou prejudiciais sobre os espermatozóides (Agarwal and Prabakaran, 2005). Níveis baixos de ROS são essenciais para a fertilização, reacção acrossómica, hiperativação, motilidade, capacitação (Agarwal and Prabakaran, 2005, Lanzafame et al., 2009, Saalu, 2010).

Níveis elevados de ROS podem levar a:

 Apoptose, num processo em que os ROS levam à disrupção da membrana mitocondrial, que leva à libertação de citocromo c, que leva à cascata de caspases (Agarwal and Prabakaran, 2005);

 Peroxidação lipídica (LPO), que é definida como a oxidação de PUFA, sendo que as membranas dos espermatozóides são muito sensíveis à LPO pois são ricas em PUFA. Em espermatozóides tem sido verificado o malonildialdeído (MDA), que é um produto final de LPO (Saalu, 2010);

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 Alteração na motilidade, apesar de existir uma correlação clara a etiologia não se mostra assim tão clara, sendo que existem algumas teorias para este facto, como por exemplo: o H2O2 conseguir difundir-se através da membrana e inactivar algumas enzimas vitais; outra é que

existe o desencadear de eventos que levam à diminuição da fosforilação proteica do axonema e consequente imobilização, apesar disto ambas carecem de confirmação (Makker et al., 2009);

 Dano no DNA, apesar dos espermatozóides terem sistemas de defesa contra o dano (o empacotamento do DNA e o sistema antioxidante) o stresse oxidativo tem sido associado a quebras duplas e simples nas cadeias de DNA. Os ROS são também capazes de causar vários tipos de mutações pontuais e polimorfismos (Makker et al., 2009, Saalu, 2010);

 Dano nas proteínas, os aminoácidos sulfurados, especificamente os que contêm o grupo tiol, são altamente susceptíveis ao stresse oxidativo. Muitos aminoácidos sofrem modificações irreversíveis quando oxidados. O dano oxidativo pode levar à clivagem da cadeia polipeptídica e por consequência à formação de agregados proteicos (Agarwal and Prabakaran, 2005).

Visto os ROS terem tanto um papel fisiológico como patológico, os organismos aeróbios desenvolveram uma série de mecanismos de defesa que foram apelidados de antioxidantes. Estes podem ser enzimáticos, sendo que as enzimas mais importantes são a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), as glutatião peroxidase (GPX), a glutatião S-transferase (GST) e a glutatião redutase (GR); ou antioxidantes com pequena massa molecular, como as vitaminas A, E e C, a coenzima Q, o zinco, o ácido úrico, a melatonina, o citocromo c e o glutatião reduzido (GSH) (Aitken and Roman, 2008, Lanzafame et al., 2009).

A SOD elimina o anião superóxido quer este seja intracelular quer seja extracelular e previne a peroxidação lipídica da membrana plasmática. Para actuar sobre o H2O2 deve ser

conjugado com a CAT e a GPX (Lanzafame et al., 2009). A SOD previne a capacitação e hiperativação prematuras induzida pelos radicais superóxidos antes da ejaculação (de Lamirande and Gagnon, 1995a). Dada a importância da SOD para os espermatozóides os testículos têm não só as formas convencionais citoplasmáticas (Cu/Zn) e mitocondriais (Fe/Mn) como também uma forma extracelular pouco convencional, SOD-Ex que são produzidas nas células de Sertoli (Aitken and Roman, 2008).

O sistema GPX/GR oferece uma excelente protecção contra a peroxidação lipídica da membrana. A GR estimula a redução de glutationa dissulfeto (GSSG) em GSH (Aitken and Roman, 2008).

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A CAT catalisa a dismutação de H2O2 em água e oxigénio. Além disso a catalase activa a

capacitação induzida por óxido nítrico que é um complexo mecanismo que envolve H2O2 (de

Lamirande et al., 1997).

A GST é uma enzima essencial à desintoxicação celular de substâncias como carcinogéneos químicos, poluentes ambientais e agentes quimioterápicos, estas transferases inactivam ainda aldeídos insaturados α e β, quinonas, epóxidos e hidroperóxidos formados como metabolitos secundários do stresse oxidativo (Hayes and Strange, 2000), catalisando a conjugação de GSH com várias substâncias, protegendo assim componentes celulares como DNA, proteínas e lípidos (Andonian and Hermo, 2003).

Alterações no rácio oxidante/antioxidante no plasma seminal podem causar stresse oxidativo provocando as supracitadas alterações nos espermatozóides. Os espermatozóides são mais sensíveis ao stresse oxidativo que as células somáticas o que poderá estar relacionado com a menor quantidade de citoplasma presente nestes o que pode ser associado a uma menor capacidade antioxidante (Agarwal et al., 2004, Agarwal and Sekhon, 2010). Esta deficiência na capacidade antioxidante enzimática torna-se mais evidente com a idade, pois os espermatozóides de homens mais velhos apresentaram menor actividade de glutationa peroxidase e de SOD. Além disto, também a membrana plasmática dos espermatozóides, especialmente rica em PUFA, torna- os especialmente sensíveis à peroxidação lipídica (Agarwal et al., 2004, Weir and Robaire, 2007, Lanzafame et al., 2009, Agarwal and Sekhon, 2010).

Objectivos

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Objectivos

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O objectivo deste trabalho é avaliar parâmetros biológicos espermáticos que poderão condicionar a fertilidade masculina. Como complemento a este objectivo foram propostos objectivos parciais nas 66 amostras em estudo:

 Realizar espermograma nas 66 amostras;

 Realizar culturas celulares, manipulação, bandeamento e análise citogenética nas 66 amostras;

 Verificar a presença de aneuploidias espermáticas dos cromossomas sexuais por FISH em 25 amostras;

 Avaliar o estado oxidativo através da quantificação de MDA, hidroperóxidos e tióis totais em pelo menos 30 amostras;

 Avaliar a actividade de enzimas antioxidantes (SOD GST e CAT) em pelo menos 45 amostras;

 Analisar o dano no DNA nos espermatozóides, em pelo menos 50 amostras, pelas técnicas de TUNEL e cometa;

Material e Métodos

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