Conception de logiciel ou Software Design

Imediatamente após ejaculação, o fluido seminal é composto por um coágulo que desaparece espontaneamente por acção enzimática após 30-60 minutos na estufa a 37°C. No caso da liquefacção ocorrer a amostra apresentava um aspecto homogéneo; caso esta não ocorresse a amostra apresentaria um aspecto heterogéneo com grumos gelatinosos no fluido.

2.2. Viscosidade

A viscosidade é determinada observando-se a filância de uma gota de esperma. Se a amostra é expulsa da pipeta em pequenas gotas trata-se de uma viscosidade normal; se a amostra ao ser expulsa forma um filamento de cerca de 2 cm estamos na presença de viscosidade aumentada; e se se encontrar completamente líquida esta possui viscosidade diminuída.

Material e Métodos

30

2.3. Cheiro

Apesar de ser o mais subjectivo dos parâmetros as amostras podem apresentar cheiro “sui generis” ou característico, cheiro putrefacto ou fétido ou ainda não ter qualquer cheiro.

2.4. Cor

A amostra normal é caracterizada por uma cor cinzento-esbranquiçado opaca. No entanto podem existir alterações como cor amarelo claro, avermelhada ou amarelo brilhante.

2.5. Volume

O volume da amostra deve ser medido com uma pipeta graduada de 5 a 10 mL, podendo variar entre 2 e 6 mL.

2.6. pH

O pH é avaliado com uma fita reactiva indicadora de pH. Esta é mergulhada por 10 segundos na amostra, retirada e a cor resultante é posteriormente comparada com a escala calibrada de pH. O valor normal varia entre 7,2 e 8,0.

2.7. Motilidade

A motilidade é o primeiro parâmetro a ser avaliado dado que após a liquefacção do sémen os espermatozóides vão, progressivamente, perdendo a sua motilidade.

Começa-se por pipetar 10 µL da amostra para uma lâmina que é coberta por uma lamela, sendo que se espera 60 segundos para que a amostra estabilize. Observa-se no microscópio de contraste de fase com a objectiva de 40x e procede-se ao cálculo da percentagem de espermatozóides por categoria de movimento, contando-se 200 células com auxílio do contador manual. Estas categorias utilizadas são Imóvel quando existe a ausência de movimento; Móvel in

situ, quando o movimento não é progressivo ou existe apenas movimento da cauda; Progressivo

lento quando o espermatozóide apresenta movimento progressivo mas não muito rápido ou sem trajectória bem definida; e ainda Progressivo rápido se se trata de um espermatozóide com movimento progressivo rápido e com trajectória bem definida.

2.8. Vitalidade

A vitalidade é o segundo parâmetro a ser avaliado, pois, assim como a motilidade, ela também pode ser afectada com o passar do tempo.

Material e Métodos

31

O princípio subjacente a esta técnica baseia-se é que caso a membrana celular da cabeça do espermatozóide estiver intacta (supostamente vivo) o espermatozóide não é corado, ficando corado se o espermatozóide não tiver a membrana intacta (Bjorndahl et al., 2004).

Num tubo devidamente identificado colocam-se 10 µL da amostra de esperma e 10 µL de Eosina Y a 0,5 %. Aguardam-se 5 minutos. Retiram-se 10 µL da solução, colocam-se sobre uma lâmina e com a ajuda de outra lâmina, faz-se um esfregaço. Depois de seco observa-se ao microscópio de campo brilhante com a objectiva de 40x. Com o auxílio do contador manual faz-se a contagem do número de espermatozóides corados de vermelho e verde até um total de 200 espermatozóides. No fim regista-se a percentagem de espermatozóides verdes.

2.9. Teste Hipoosmótico

A realização do teste hipoosmótico fornece-nos uma informação complementar à vitalidade.

Retiram-se 10 µL da amostra que são adicionados a 90 µL de solução hipoosmótica e deixa-se a mistura a incubar por 30 minutos. Em contexto hipoosmótico acontece um desequilíbrio osmótico entre o meio extracelular e intracelular que a célula, caso tenha a membrana plasmática intacta, compensa deixando entrar água para o compartimento intracelular e como consequência o espermatozóide aumenta o seu volume e as caudas dilatam e enrolam-se (World Health Organization., 2010). Após este tempo retiram-se 10 µL da mistura e cobre-se com uma lamela. Observa-se no microscópio de contraste de fase com a objectiva de 40x. Contam-se 200 espermatozóides, distinguindo os espermatozóides de cauda enrolada dos espermatozóides com a cauda intacta e procede-se ao cálculo de percentagem dos espermatozóides com cauda enrolada.

2.10. Concentração

A avaliação da concentração de espermatozóides foi feita por contagem celular com um hemocitómetro ou câmara de Neubauer. Fez-se uma primeira observação a fresco ao microscópio de contraste de fase para fazer uma avaliação rápida da concentração de espermatozóides de forma a prever a diluição a utilizar. A diluição é feita de acordo com o Tabela 1.

Material e Métodos

32

Tabela 1. Diluições usadas no cálculo da concentração de espermatozóides. Adaptado de World Health

Organization (2010) Nº espermatozóides/campo (objectiva 40x) Diluição Volume a adicionar Sémen (µL) Fixador (µL) Swim up 1+1 (1:2) 100 100 <15 1+4 (1:5) 100 400 15-40 1+9 (1:10) 50 450 40-200 1+19 (1:20) 50 950 >200 1+49 (1:50) 50 2450

Preparou-se um tubo com o diluente correspondente e pipetou-se e transferiu-se o volume exacto de sémen, bem homogeneizado, para o tubo com o diluente, com uma micropipeta de deslocamento positivo. Posteriormente agitou-se no vórtex durante, pelo menos, 15 segundos. Em seguida transferiu-se 10 µL da diluição para uma das câmaras do hemocitómetro e repetiu-se para a segunda câmara, deixou-se a câmara de Neubauer em câmara húmida durante 15-20 minutos. A contagem foi realizada no microscópio de contraste de fase com a objectiva de 40x, contando-se apenas os espermatozóides íntegros, ou seja, que apresentam cabeça e cauda. Para a contagem utiliza-se apenas os compartimentos central da câmara, que se encontra dividido em 25 quadrados grandes. A contagem é feita segundo a Tabela 2.

Tabela 2. Valores do factor de conversão para a câmara de contagem Neubauer. Adaptado de World Health

Organization (2010)

Diluição Nº de quadrados grandes contados

25 10 5 1:2 100 40 20 1:5 40 16 8 1:10 20 8 4 1:20 10 4 2 1:50 4 1.6 1.8

A concentração de espermatozóides é calculada segundo a fórmula:

Número de spz/mL = nº de spz contados em “X” quadrados grandes x 106 Factor de conversão (Tabela 2)

Material e Métodos

33

Quando no exame a fresco se observa um número muito reduzido de espermatozóides, para determinar a concentração, coloca-se uma gota de esperma directamente na câmara de Neubauer, contam-se os espermatozóides observados em 5 dos 9 compartimentos e multiplica-se o número obtido por 2000.

2.11. Morfologia

A morfologia é o último dos parâmetros a ser avaliado, sendo que esta pode ser efectuada num dia diferente do da colheita.

Coloca-se uma gota de 10 µL de sémen bem misturado e não diluído numa lâmina e faz-se um esfregaço deixando-se secar. Posteriormente mergulha-se a lâmina em metanol, por aproximadamente 10 segundos com o intuito de fixar as células e deixa-se secar. Em seguida mergulha-se a lâmina no corante de Papanicolau durante 15 minutos e no final passa-se a mesma por água corrente para se retirar o excesso de corante. Após este passo mergulha-se a lâmina no corante Shorr durante 5 minutos e passa-se por água corrente para se retirar o excesso de corante. Realiza-se nova fixação com metanol durante 10 segundos e deixa-se secar.

A análise das lâminas realizou-se com auxílio do microscópio de campo brilhante na ampliação de 100x com a objectiva de imersão. Contam-se 200 espermatozóides e calcula-se a percentagem de cada classe morfológica de acordo com a supracitada classificação da OMS de 2010. Essa classificação divide as anomalias em três tipos: anomalia da cabeça, da peça intermédia e da cauda.

A coloração das várias estruturas do espermatozóide está descrita na Tabela 3.

Tabela 3. Coloração das diferentes estruturas dos espermatozóides

Região do espermatozóide corada Coloração

Acrossoma Azul claro Região pós acrossómica Azul escuro

Peça intermédia Azul escuro

Cauda Azul escuro

Restos citoplasmáticos Avermelhados

Posteriormente seria calculado do Índice Teratozoopérmico que consiste no somatório das percentagens das diferentes alterações a dividir pela percentagem de células morfologicamente anormais.

Material e Métodos

34

2.12. Classificação

Feita a avaliação das amostras foram classificadas de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (World Health Organization., 2010).

 Normozoospermia – amostras com os parâmetros espermáticos normais;

 Astenozoospermia – amostras com baixa motilidade;

 Teratozoospermia – amostras com SPZ com morfologia normal inferior a 4%;

 Oligozoospermia – amostras com baixa concentração de SPZ;

 Astenoteratozoospermia – amostras com baixa motilidade e morfologia;

 Oligoastenozoospermia – amostras com baixa concentração e motilidade

 Oligoteratozoospermia – amostras com baixa concentração e morfologia

 Oligoastenoteratozoospermia – amostras com número total de espermatozóides baixo, baixa motilidade e morfologia;

 Necrozoospermia – amostras com baixa motilidade e elevada percentagem de imóveis.

Tabela 4. Valores normais dos parâmetros espermáticos (World Health Organization., 2010).

Liquefacção Completa aos 60

minutos Concentração ≥ 20 x 10

6 _{< 250 x 10}6

pH 7,2 – 8 Vitalidade ≥ 60%

Volume do ejaculado 2 – 6 mL Motilidade Móveis Progressivos ≥ 50%

ou PR ≥ 25%

Teste hipoosmótico ≥ 60% Morfologia Típicos ≥ 4%

Concentração ≥ 40 x 106

3. A

NÁLISE

C

ITOGENÉTICA

A análise cromossómica foi realizada em linfócitos T estimulados por fitohemaglutinina, provenientes de sangue periférico, utilizando métodos citogenéticos convencionais (bandagem GTL e CBL). Realizou-se uma cultura celular de 72h procedendo-se de seguida à sua manipulação até à obtenção de cromossomas, de acordo com os protocolo estabelecido no laboratório. O protocolo utilizado encontra-se no Anexo 1.

Material e Métodos

35

3.1. Método de bandeamento GTL

As bandas GTL (usando como corante o corante de Leishman) são obtidas após tratamento das lâminas (que contêm as metáfases) com uma solução de Tripsina (enzima proteolítica) à temperatura ambiente. O tempo de exposição a esta enzima é crucial, devendo ser rigorosamente controlado e testado antes de ser aplicado.

Com o intuito de interromper a acção da Tripsina as lâminas foram sujeitas a lavagens rápidas em solução salina e tampão Gurr, respectivamente, e à temperatura ambiente.

As lâminas foram coradas com o já referido corante de Leishman (solução de trabalho) durante 5 minutos, protegido da luz, pois esta degrada o corante.

Seguiram-se lavagens em tampão Gurr e água destilada à temperatura ambiente. Posteriormente as lâminas secaram ao ar.

A observação das lâminas fez-se com auxílio do microscópio óptico Leica DM4000B (Leica, Alemanha), e a cariotipagem executou-se através da examinação e captação de imagens de, pelo menos, 20 metafases diferentes com o programa Leica- CW 4000 Kario (Leica, Alemanha).

3.2. Método de bandeamento CBL

Todas as amostras foram ainda sujeitas a bandeamento CBL, que resultam na coloração da heterocromatina constitutiva. As bandas C são obtidas através da exposição a hidróxido de bário e são coradas com corante de Leishman. Os cromossomas metafásicos são sujeitos a condições ácidas, alcalinas e salinas e a altas temperaturas. Este bandeamento foi realizado para excluir a inclusão de material cromossómico no cromossoma Y que é marcadamente heterocromático, principalmente na porção distal do seu ramo longo.

Após descoloração em fixador, as lâminas foram mergulhadas em HCl à temperatura ambiente durante 1 hora. A aproximadamente 5 minutos antes de acabar esta hora adicionou-se 10 mL de Ba(OH)2 pré-aquecido a 40 mL de água destila (pré-aquecida a 60°C), obtendo-se uma solução de Ba(OH)2 a 1% e deixou-se arrefecer até os 55°C.

Em seguidas as lâminas foram lavadas em água destilada à temperatura ambiente e colocadas na solução de Ba(OH)2 a 1% a 55°C durante 3 a 5 segundos. O tempo de exposição a Ba(OH)2 deve ser rigoroso.

Posteriormente, procederam-se 2 lavagens em água destilada previamente aquecida a 60°C com leve agitação, para remover o precipitado das lâminas e foram colocadas em 2x SSC a 60°C durante 1 hora.

Material e Métodos

36

Foi de seguida feita uma nova lavagem em água destilada à temperatura ambiente, seguida de coloração em corante de Leishman durante 1 hora (protegido pela luz, pois o corante é fotodegradável). Finalmente executou-se uma última lavagem em água destilada à temperatura ambiente e deixaram-se a secar ao ar.

A observação das lâminas fez-se com auxílio do microscópio óptico Leica DM4000B (Leica, Alemanha), e a cariotipagem executou-se através da examinação e captação de imagens com o programa Leica- CW 4000 Kario (Leica, Alemanha).

4. P

REPARAÇÃO DO

E

SPERMATOZÓIDES

Pela impossibilidade realizar todas as técnicas em fresco as amostras tinham que ser devidamente preparadas.

Após a colheita retirou-se, quando possível, pelo menos 600µL de amostra total para um tubo eppendorf devidamente identificado que era posteriormente guardado a -20°C e que viria a ser usado para as técnicas de actividade enzimática, TBARS, Fox e Tióis totais.

Retirou-se também 200µL, para dois tubos eppendorf devidamente identificados, que eram sujeitos a 3 lavagens com 1 mL de 1X PBS, sendo efectuadas centrifugações de 10 minutos a 1200rpm. Após estas lavagens adicionou-se 1mL de solução fixadora (metanol/ácido acético 3:1 no caso do FISH; 4% paraformaldeído para TUNEL). As amostras eram posteriormente armazenadas a -20°C até serem utilizadas.

Retirou-se 200 µL de amostra, total para um tubo eppendorf devidamente identificado, colocou-se durante 10 minutos em vapor de azoto líquido e foi armazenado em azoto líquido até ser utilizado para o ensaio de cometa.

5. A

NEUPLOIDIAS

E

SPERMÁTICAS

Para a detecção de aneuploidias espermáticas foi utilizada a técnica de hibridação in situ por fluorescência (FISH). Foi utilizada sonda alfa-satélite (região centromérica) para os cromossomas X (DXZ1) / Y (DYZ3) da Kreatech, Holanda.

A descondensação do DNA foi realizada por intermédio de uma lavagem com solução de NaOH 1mol/L por 2 minutos à temperatura ambiente, seguida de duas lavagens numa solução de 2x SSC a 37°C durante 2 minutos. A desidratação foi feita através de uma sequência de banhos de etanol a 70%, 85% e 96%, respectivamente, à temperatura ambiente durante 2 minutos cada.

Material e Métodos

37

A sonda foi preparada adicionando-se 4,5 µL de solução de hibridação e 0,5 µL de sonda. Esta mistura foi posteriormente homogeneizada e realizado spin down. Colocaram-se 5 µL de mistura na área pretendida, cobriu-se com uma lamela e colocaram-se as lâminas numa placa de aquecimento a 75°C durante 5 minutos para que ocorresse a desnaturação da sonda e da amostra.

A hibridação da sonda foi realizada durante a noite (± 16 horas), tendo-se incubado as lâminas a 37°C numa caixa húmida previamente aquecida. Posteriormente, retiraram-se as lamelas e procederam-se duas lavagens, a primeira em 0,4x SSC com 0,3% Igepal (Sigma, EUA) a 72°C durante 2 minutos e a segunda em 2x SSC à temperatura ambiente durante 1 minuto. De seguida colocaram-se as lâminas em ambiente escuro e deixaram-se secar.

As lâminas foram contrastadas com 4 µL de VECTASHIELD (Mounting Medium With Dapi, Vector Laboratories, Inglaterra), cobertas com uma lamela e guardadas a 4°C até serem observadas.

6. S

TRESSE

O

XIDATIVO

6.1. Quantificação de proteína

A quantificação da proteína foi determinada pelo método colorimétrico do Biureto (Gornall et al., 1949). Este método baseia-se na reacção de CuSO em solução alcalina (reagente de Biureto) com as ligações peptídicas das proteínas, originando um complexo de cor violeta. As amostras de suspensão mitocondrial (20 e 40L) foram solubilizadas pela adição de 100L de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 10% (p/v). Adicionou-se água desmineralizada até perfazer 2mL e, em seguida, 2mL de reagente alcalino de cobre (reagente de “biureto”: CuSO4.5H2O a 0,15 %

(p/v), tartarato de sódio e potássio (NaKC4H4O6.4H2O) a 0,6% (p/v), NaOH a 3% (p/v) e KI a 0,1%

(p/v)). Prepararam-se padrões de BSA (0-2,4mg) em condições idênticas às das amostras, contendo 50 L de meio de lavagem. As absorvências das amostras e dos padrões foram lidas ao fim de 15min de reacção, a 540nm num espectrofotómetro UV-Vis (Spectronic® GenesysTM2PC),

Material e Métodos

38

Dans le document Génie Logiciel (Page 53-59)