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Como resultado da execução deste trabalho, foi elaborado um artigo intitulado: “Superexpressão da 8-hidroxi-2’-deoxiguanosinaem líquen plano oral”. O referido artigo será submetido ao periódico Journalof Oral Pathology& Medicine (Qualis Odontologia A2).

Análise imuno-histoquímica da 8-hidroxi-2’-deoxiguanosina

emlíquenplano oral

Immunohistochemical analysis of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosin

in oral lichen planus

Ana Carolina Macedo da Silva Diasa Roseana de Almeida Freitasb*

a _{Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas - Universidade}

Federal do Rio Grande do Norte, Natal/RN, Brasil.

b _{Professora Doutora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas -}

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal/RN, Brasil. ____________________________________________________ Autor correspondente (*):

Dr.ª Roseana de Almeida Freitas

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas.

Av. Senador Salgado Filho, 1787 - Lagoa Nova, Natal/RN, Brasil. CEP 59056-000

Phone/Fax: +55 84 3215-4138 E-mail:[email protected]

Resumo

Introdução: O líquen plano oral é uma doença mucocutânea crônica imunomediada e relativamente comum na mucosa oral. A patogênese ainda é desconhecida e muito se tem estudado sobre o estresse oxidativo nessa lesão, sendo a8-hidroxi-2’-deoxiguanosinagerada após danos oxidativos no DNA. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o dano oxidativo ao DNA no líquen plano oral através da expressão imuno-histoquímica da 8-hidroxi-2’- deoxiguanosina. Métodos: a imunoexpressão da proteína foi avaliada semiquantitativamente em 46 casos de líquen plano oral e 17 amostras de mucosa oral clinicamente normal e os dados submetidos â análise estatística por meio dos testes não-paramétricos de Kruskall- Wallis e Mann Whitney, com nível de significância estabelecido em 5% (p> 0,05). Resultados: foi observada tendência à maior imunoexpressão nuclear nos subtipos erosivos, em comparação aos reticulares e à mucosa oral normal (p=0,088). Também foi observada tendência à maior intensidade de marcação nos casos de líquen plano oral se comparados à mucosa oral normal (p=0,085). Em relação à sintomatologia, foi observada maior imunomarcação tanto citoplasmática quanto nuclear (p=0,004 e p=0,016, respectivamente) nos casos sintomáticos. Conclusões: os resultados deste estudo indicam uma forte expressão imuno-histoquímica da 8-hidroxi-2’-deoxiguanosinaem líquen plano oral, sugerindo o papel do estresse oxidativo na patogênese desta doença.

Introdução

O Líquen Plano (LP) é uma doença crônica imunologicamente mediada e inflamatória, que afeta a pele e membranas mucosas, tendo sido recentemente descrita também como uma condição psicossomática, uma vez que seu desenvolvimento e exacerbação encontram-se bastante relacionados a períodos de tensão emocional1,2. O Líquen Plano Oral (LPO) é a variante oral do LP. As lesões orais geralmente precedem as lesões em pele e podem até representar a única manifestação da doença3_.

A Organização Mundial da Saúde (OMS) classifica o LPO como uma desordem potencialmente maligna4. As taxas de transformação maligna relatadas na literatura variam bastante, mas a maioria dos estudos relatam uma taxa de cerca de 1%, sendo o LPO erosivo o subtipo clínico com maiores taxas de malignização5.

A etiologia do LPO é incerta e a patogênese ainda é alvo de pesquisas, destacando-se as que têm relacionado o estresse oxidativo à patogênese dessa lesão6,7. O estresse oxidativo é definido como o desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio e a capacidade do organismo de excretar esses intermediários ou de reparar o dano causado por eles8. Sabe-se que as células são expostas a estresses oxidativos devido ao metabolismo respiratório normal ou a reações imunes9.

A 8-hidroxi-2’-deoxiguanosina (8-OHdG) é gerada após danos oxidativos na base nucleosídica 2’-desoxiguanosina, sendo uma forma oxidada desta10. Acredita-se que determinar o status oxidativo/antioxidante de uma doença inflamatória, como o LPO, pode ser útil para avaliar sua gravidade e monitorar a evolução e resposta ao tratamento da doença11.

Em virtude das incertezas a respeito da patogênese do LPO, de poucos estudos terem analisado a 8-OHdG nesta lesão12,13,14,15,16,17e com o intuito de buscar ferramentas terapêuticas adicionais, o presente estudo visa avaliar o dano oxidativo do DNA no LPO através da expressão imuno-histoquímica da 8-OHdG, para verificar se esse mecanismo pode estar envolvido na patogênese dessa lesão.

Material e métodos

Após aprovação pelo Comitê Nacional de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) (parecer 3.382.706), foram selecionados de forma intencional não probabilística 46 casos de LPO (29 do subtipo reticular e 17 do subtipo erosivo). Todos os casos foram diagnosticados e encontravam-se arquivados no Laboratório de Anatomia

Patológica e Citopatologia do Departamento de Odontologia da UFRN. Para uma análise comparativa, foram utilizados 17 casos de mucosa oral normal obtidos de espécimes teciduais oriundos de cirurgia de remoção de lábio duplo (7 casos) e espécimes de gengiva clinicamente saudável (10 casos) provenientes de cirurgia de aumento de coroa clínica.

Os casos selecionados foram de pacientes diagnosticados com LPO sem histórico de tratamento prévio à realização da biópsia, com a ficha clínica devidamente preenchida e com blocos com espécime biológico suficiente para confecção das lâminas histopatológicas. Foram excluídos os casos de pacientes tabagistas, ex-tabagistas que pararam de fumar há menos de 10 anos e etilistas; pacientes sob tratamento que não compareceram às consultas de acompanhamento; e pacientes que não se enquadraram nos critérios clínicos e histopatológicos sugeridos por Cheng et al. (2016).

A resposta à terapia para os casos dos pacientes diagnosticados com LPO erosivo foi observada a partir de avaliação do prontuário destes pacientes, que haviam sido atendidos e acompanhados na Clínica de Estomatologia da UFRN para aplicação de protocolo terapêutico à base de solução de propionato de clobetasol a 0,05% sem álcool, no qual foram realizados bochechos de 10ml da solução, por um minuto, quatro vezes ao dia, durante 15 dias ou, nos casos de persistência da lesão, por mais 15 dias.

Os espécimes de LPO e mucosa oral normal, fixados em formol a 10% e emblocados em parafina, foram submetidos a cortes de 3µm de espessura e posteriormente estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas e silanizadas e preparadas para a coloração imuno- histoquímica com o anticorpo anti-8-OHdG na concentração de 1:400 (Santa Cruz BiotechnologiesInc®, MO, USA) com tempo de incubação de 60 minutos à temperatura ambiente. O controle negativo consistiu na omissão do anticorpo primário.

A análise da expressão da 8-OHdG foi realizada por um examinador previamente calibrado e submetido ao teste kappa (κ=0,916). Foram avaliadas as marcações nuclear e citoplasmática, de formas independentes, sendo consideradas positivas as células que apresentaram coloração acastanhada no núcleo e/ou citoplasma, independentemente da intensidade. A imunorreatividade foi avaliada de formasemi-quantitativa, através de uma adaptação da metodologia utilizada por Ma et al (2006), sendo feita uma avaliação baseada na porcentagem de células epiteliais marcadas ao longo de todo epitélio da área mais representativa da lesão. A porcentagem de marcação foi classificada com os escores 0 para marcação ausente; 1 para marcação inferior a 25%; 2 para marcação entre 25% e 50%; 3 para marcação entre 50% e 75%; e 4 para marcação maior do que 75%. A intensidade de marcação foi classificada em ausente, fraca, moderada e forte. Os dados obtidos foram submetidos aos

testes não-paramétricos de Kruskall-Wallis (KW) e Mann-Whitney (U). O nível de significância foi estabelecido em 5% (p<0,05).

Resultados

A amostra deste estudo foi constituída por 29 casos de LPO reticular e 17 casos de LPO erosivo. A maioria dos casos era de pacientes do sexo feminino e a idade variou de 21 a 83 anos, com média de 50,3 anos (Desvio padrão de ± 13,9), sendo a maioria da amostra composta por pacientes com mais de 40 anos de idade. A maioria era de pardos ou negros. Com relação à localização anatômica, a mucosa jugal foi a mais acometida, seguido pela língua e gengiva.

A maioria dos pacientes da amostra apresentava sintomatologia dolorosa. O tempo de evolução relatado pelos pacientes variou de 1 mês a 10 anos, embora a maioria dos casos tenham tido tempo de evolução menor do que 2 anos. No tocante à história médica dos pacientes da amostra, foi relatado por alguns pacientes diabetes mellitus, hipertensão, ansiedade, estresse, depressão e um paciente relatou apresentar hipertireoidismo. Dos 11 casos de LPO erosivo que tiveram acompanhamento clínico, 5 casos obtiveram resposta total à terapia, 5 casos mostraram resposta parcial e 1 caso apresentou resistência à terapia. Destes 11 casos, 8 foram tratados durante 15 dias e apenas 3 precisaram estender o tratamento por mais 15 dias. O perfil clínico e epidemiológico da amostra encontra-se detalhado na Tabela 1.

Análise imuno-histoquímica

Todos os casos de LPO apresentaram imunorreatividade ao anti-8-OHdG, que normalmente estava expresso em todas as camadas do epitélio, sendo, mais evidente na camada basal. Embora a marcação citoplasmática fosse normalmente observada em mais camadas epiteliais do que a marcação nuclear, na maioria dos casos, evidenciou-se marcação nuclear com uma intensidade superior. Também foi observado imunoexpressão de 8-OHdG no infiltrado inflamatório, células endoteliais e células musculares. O epitélio de mucosa oral normal apresentou marcação variável, sendo os espécimes provenientes de cirurgia de lábio duplo apresentando menor imunomarcação em comparação com os espécimes de gengiva clinicamente saudável (Figura 1).

Com relação à expressão da 8-OHdG no LPO reticular, erosivo e mucosa oral normal, foi observada predominância do escore 4. Entretanto, foi evidenciada prevalência das

intensidades fortes e moderadas para os dois subtipos estudados do LPO, enquanto na mucosa oral normal observou-se predominância das intensidades fraca e moderada. Esses resultados encontram-se detalhados na tabela 2.

Análise estatística

No que diz respeito à marcação citoplasmática, o teste de Kruskall-Wallis não evidenciou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos estudados. Por outro lado, para a marcação nuclear, foi observada tendência à maior imunoexpressão da 8-OHdG nos LPOs erosivos, em comparação aos LPOs reticulares e à mucosa oral normal. Contudo, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (Tabela 3).

No que diz respeito à relação entre a imunopositividade para o 8-OHdG e as características clínicas do LPO, foi evidenciada uma maior imunoexpressão tanto citoplasmática quanto nuclear (p = 0,004 e p = 0,016, respectivamente) nos casos sintomáticos em comparação com os casos assintomáticos. Entretanto, não foram observadas diferenças significativas entre a idade, a presença ou não de lesões múltiplas e a resposta ao tratamento com a imunoexpressão do 8-OHdG (Tabelas 4 e 5).

Discussão

Muito se tem estudado a respeito da patogênese do LPO e o estresse oxidativo tem sido foco de pesquisas7,8. Poucos trabalhos avaliaram a 8-OHdG no LPO e, entre estes, a maioria avaliou esse marcador através dos níveis salivares ou plasmáticos14,15,16,17 ou por meio da técnica de imunofluorescência12,13, não tendo sido encontrado na literatura nenhum estudo imuno-histoquímico com 8-OHdGem LPO.

No que concerne ao tratamento do LPO, García-Pola et al. (2017) realizaram uma revisão sistemática utilizando uma amostra de 55 artigos científicos. Esses autores constataram que a terapia com glicocorticoide é a mais estudada, sendo a triancinolona o fármaco mais utilizado, seguido pelo propionato de clobetasol e pela dexametasona. Dentre os estudos avaliados na revisão sistemática, o estudo de Javadzadeh, et al. (2008) utilizou o propionato de clobetasol a 0,05% em forma de solução, assim como foi feito nesta pesquisa, com protocolo de aplicação de bochechos 4 vezes ao dia. Entretanto, na pesquisa de Javadzadeh et al. foi avaliado um novo enxaguatório bucal contendo propionato de clobetasol a 0,05% associado a amitriptilina e cetoconazol. Observou-se uma melhor resposta terapêutica do novo enxaguatório bucal, em

comparação com o grupo controle (dexametasona associada a nistatina e a difenidramina), além de probabilidade de nenhuma recorrência em 3 meses de acompanhamento, comparado a uma probabilidade de recorrência de 100% no grupo controle.

No nosso estudo, não foi realizada associação entre fármacos, já que utilizamos apenas a solução de propionato de clobetazol. Dos 11 pacientes tratados que compareceram às consultas de acompanhamento, 5 obtiveram resposta total à terapia, 5 obtiveram resposta parcial e 1 foi completamente resistente à terapia, o que pode sugerir que a associação do propionato de clobetazol com outros fármacos pode ser eficiente no manejo do LPO, sendo, portanto, fundamental outros estudos clínicos com amostras mais significativas.

Todos os casos desta pesquisa obedeceram aos critérios de diagnóstico sugeridos por Cheng et al. (2016), que consideraram LPO lesões multifocais, aproximadamente simétricas; lesões brancas e vermelhas exibindo uma ou mais das seguintes formas: reticular/papular, atrófica, erosiva, placa, bolhosa; lesões não localizadas exclusivamente em locais onde são colocados tabacos sem fumaça ou exclusivamente adjacente a restaurações dentárias; ademais, o aparecimento das lesões não deve estar correlacionado com o início de uma medicação nem com o uso de produtos contendo canela.. Quanto aos critérios histopatológicos, Cheng et al. destacaram a necessidade de haver um infiltrado inflamatório em banda, próximo a região da camada basal, predominantemente linfócito; exocitose linfocítica; ausência de displasia epitelial e de alterações epiteliais com arquitetura verrucosa.

. É possível que as grandes controvérsias ainda existentes na literatura em torno do LPO sejam influenciadas pela falta do cumprimento rigoroso de critérios de diagnóstico. Idrees et al. (2020), em sua metanálise que avaliou a transformação maligna em LPO com critérios de diagnósticos e de inclusão bem rigorosos, eles concluíram que as taxas de transformação maligna são superestimadas devido aos critérios de diagnóstico não serem seguidos rigorosamente.

No que diz respeito à imunomarcação do 8-OHdG na nossa amostra, observou-se marcação tanto a nível nuclearquanto citoplasmático, o que pode ser explicado pelo fato do 8- OHdG ser produzido não só no DNA nuclear, mas também no DNA mitocondrial, conforme afirmou Wu et al. (2017). Não obstante, Chayarit et al. (2005) observaram imunomarcação principalmente a nível nuclear, havendo pouca imunomarcação citoplasmática. Essa diferença pode ser explicada pelas divergências nas técnicas utilizadas, uma vez que na presente pesquisa foi realizado um estudo imuno-histoquímico, enquanto Chayarit et al. (2005) realizaram uma análise por imunofluorescência, e até mesmo pelas diferenças na especificidade e/ou sensibilidade dos anticorpos utilizados. Por outro lado, o estudo de

Yoshifuku, Fujii e Kanekura (2018), que realizou uma análise imuno-histoquímica da 8- OHdG observou que este biomarcador se expressou tanto no núcleo como no citoplasma, apesar da marcação nuclear ser predominante e mais intensa, assim como foi verificado na maioria dos nossos casos.

Chayrit et al. (2005) também constataram imunomarcação em toda a amostra de LPO, sendo esta mais evidente na camada basal do epitélio, assim como foi observado na presente pesquisa; e também foi observado imonomarcação entre as células inflamatórias, de forma semelhante aos nossos resultados. Madhulika et al. (2015) realizaram um estudo caso controle para detectar o dano de DNA em linfócitos em pacientes com LPO e esses autores observaram que, de fato, havia maior dano de DNA nos linfócitos destes pacientes em comparação com o grupo controle. Kawanishi et al. (2006) afirmaram que as células inflamatórias produzem EROs e, consequentemente, estão expostas a estresse oxidativo, o que pode explicar a expressão da 8-OHdG entre essas células. A imunomarcação mais evidente na camada basal pode ser explicada pela maior proximidade desta camada ao infiltrado inflamatório, estando, portanto, mais exposta aos danos gerados pelo estresse oxidativo. Isso pode ter relação com os aspectos morfológicos do LPO, no qual observa-se degeneração da camada basal do epitélio.

Com relação à imunomarcação dos espécimes de mucosa oral normal, diferentemente do estudo de Chayarit et al. (2005) e Ma et al. (2006), que observaram pouca ou nenhuma imunorreatividade, o nosso estudo observou escores altos para a mucosa oral normal, especialmente nos espécimes de gengiva. Embora He et al (2014) e Kawanish et al (2006) tenham afirmado que a 8-OHdG tem se mostrado útil para avaliar o risco de carcinogênese, os resultados da presente pesquisa nos faz questionar se a expressão desse marcador possa realmente ser confiável no que diz respeito a se avaliar o risco de transformação maligna de desordens potencialmente malignas, como o LPO.

De acordo com Kubo et al. (2014), as células são expostas a estresses oxidativos como resultado do metabolismo respiratório normal ou devido a reações imunes. Portanto, mesmo em tecidos saudáveis poderia haver a produção de 8-OHdG, especialmente na mucosa oral, que está constantemente sendo exposta a traumas e microrganismos, o que leva a uma inflamação localizada e a um estresse oxidativo nessa região. A gengiva é um local mais susceptível a trauma do que o lábio, o que pode explicar a maior imunomarcação dos espécimes de gengiva saudável em comparação com os espécimes provenientes de cirurgia para remoção de lábio duplo. Além disso, mesmo em gengivas saudáveis, é comum a presença de células inflamatórias na lâmina própria, por mais que a inflamação seja bem mais

evidente em doenças periodontais, como foi demonstrado no estudo de Vasconcelos et al. (2016).

Apesar de ter sido observado imunomarcação da 8-OHdG em mucosa normal, a presente pesquisa evidenciou tendência de maior marcação nuclear e intensidade de marcação no LPO em comparação com a mucosa oral normal, sugerindo haver maior produção de 8-OHdG e, consequentemente, maiores níveis de estresse oxidativo em pacientes com LPO. De maneira semelhante, Totan et al (2015) e Kaur et al. (2016), ao avaliarem os níveis de 8-OHdG na saliva de pacientes com LPO, observaram uma concentração bem maior nestes pacientes em comparação com o grupo controle.Agharrosseini et al. (2012) também constataram níveis de 8-OHdG significativamente maiores do que no grupo controle.Os resultados do nosso estudo e desses outros são evidências que sugerem a existência de relação entre o estresse oxidativo e a patogênese do LPO.

No que diz respeito às diferenças dos níveis de estresse oxidativo entre o LPO erosivo e reticular, Hashemy et al. (2016) observaram maior capacidade antioxidante da saliva nos pacientes com as formas ceratóticas em comparação com as formas erosiva e atrófica, sugerindo haver um maior nível de estresse oxidativo nestas últimas. Essa constatação vai de encontro com os nossos resultados, que embora não tenha havido diferenças estatisticamente significativas (p=0,088), houve uma tendência de maior expressão nuclear de 8-OHdG no LPO erosivo em comparação com a forma reticular e a mucosa oral normal. Acreditamos que a falta de significância estatística se deu devido ao tamanho da amostra de LPO erosivo, sendo fundamental outros estudos com amostras maiores.

A literatura demonstra que o LPO erosivo está mais associado à transformação maligna em comparação com os outros subtipos clínicos, conforme foi evidenciado na revisão sistemática realizada por Giuliani et al. (2019). Wu et al. (2017) e Kawanishi et al. (2006) destacaram que, se a 8-OHdG produzida não for reparada e a célula lesada não sofrer apoptose, podem ocorrer mutações transversais, induzindo o processo de carcinogênese. Além disso, Wu et al. afirmaram, também, que o aumento na 8-OHdG pode ocorrer não apenas devido a um aumento na taxa de dano oxidativo de DNA, mas também devido a um declínio na taxa de reparo.

Foi evidenciado no presente estudo uma significativa maior imunoexpressão da 8-OHdG nos casos de LPO sintomáticos em comparação com os assintomáticos. Isso provavelmente se deve ao fato de que todos os casos de LPO erosivos eram sintomáticos e a 8-OHdG foi demonstrada mais expressa no subtipo erosivo. Outra possível explicação para isso seja devido ao fato de os casos sintomáticos estarem associados a um maior grau de inflamação e,

consequentemente, estarem mais expostos aos efeitos do estresse oxidativo. Além disso, o estresse e a consequente liberação de cortisol que ocorre no paciente em decorrência da sintomatologia dolorosa poderia alterar a nível local o estresse oxidativo.

Em conclusão, o presente estudo demonstrou que o estresse oxidativo faz parte da patogênese do LPO, seja do tipo reticular ou erosivo. Entretanto, outros estudos que busquem correlação entre marcadores deste evento e episódios de exacerbação ou recidiva da doença com amostras maiores fazem-se necessários. Ademais, é fundamental a realização de mais pesquisas que visem avaliar a utilização de antioxidantes nos casos sintomáticos de LPO, já que estes podem constituir importantes alvos terapêuticos.

Referências

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