Phosphorylation

La phosphorylation est le transfert d’un groupement phosphate (PO32-_{) de l’ATP}

sur un résidu accepteur d’une protéine substrat. Les acides aminés accepteurs sont les résidus portant un hydroxyle (-OH) comme la sérine, la thréonine et la tyrosine.

La phosphorylation est sans doute la modification post-traductionnelle des RCPG la plus étudiée de nos jours. Elle influence la conformation et la charge de la protéine cible et joue de ce fait un rôle important dans son activité. La phosphorylation intervient dans de nombreuses fonctions cellulaires, dans la signalisation intracellulaire, et dans la régulation de l’activité des RCPG. En effet, la phosphorylation permet de contrôler la durée d’activation des RCPG, en provoquant une perte d’efficacité de la stimulation des voies de signalisation, ce processus est appelé désensibilisation. On distingue deux types de désensibilisation des RCPG. Une désensibilisation initiée par l’occupation du récepteur par son agoniste, la désensibilisation homologue, et la désensibilisation hétérologue qui survient après activation d’un autre récepteur présent dans la cellule.

Les kinases catalysant la réaction sont classées en différentes familles, selon les acides aminés cibles de la phosphorylation.

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II.1.1

Kinases

Les kinases sont généralement classées selon leur spécificité de substrat en deux grandes familles, les Ser/Thr kinases et Tyr Kinases. Mais selon leurs homologies de séquences et leur fonctionnalité biochimique, elles peuvent être classées en groupes, familles et sous-familles. Jusqu’ici 518 kinases humaines ont pu être identifiées et classées en 7 groupes majeurs représentés dans le dendrogramme, figure 19 [188].

Figure 19: Dendrogramme des différentes familles de kinases (Human kinome, Cell Signaling Technologies). TK : tyrosine kinase, TKL : tyrosine kinase like, STE : sterile, CK1 : casein kinase 1, CAMK: calcium calmoduline kinase, AGC et CMGC: nommé à partir de certain des membres de ces familles.

40 Introduction: Modulation de l’activité des RCPG

II.1.1.1

Déterminants structuraux

Malgré leur spécificité de substrat les protéines kinases possèdent des déterminants communs essentiels. D’un point de vue structural, le déterminant le mieux conservé, que la kinase soit Ser/Thr ou Tyr kinase, est le domaine catalytique. Elles possèdent un cœur d’environ 250 résidus relativement bien conservés formant deux lobes (figure 20) [189]. Le plus petit, le lobe N-terminal inclut les domaines I à IV, et est impliqué dans la reconnaissance et la liaison du nucléotide. Ce lobe possède presque exclusivement des feuillets . Le plus grand lobe, C-terminal, inclut les domaines VI à XI. Responsable de l’interaction avec la protéine substrat, il initie le transfert du phosphate. Il est essentiellement formé d’hélices . A l’interface des deux lobes se trouve le site catalytique. La structure de différentes protéines kinases a permis de démontrer que la conformation des deux lobes était modifiée par un repliement, lors de l’activation de la kinase. L’étude de structures [189] et l’alignement des séquences de 510 kinases humaines [190] a permis d’identifier 12 sites conservés ou sous-domaines, s’articulant autour du cœur catalytique. Les principaux sont :

Le sous-domaine I qui forme une boucle autour du triphosphate de l’ATP. Le sous-domaine II qui fait contact avec le phosphate.

Le sous-domaine III représente l’hélice C du petit lobe. Il stabilise l’interaction avec les phosphates de l’ATP.

Les sous-domaines VIb et VII sont directement impliqués dans l’activité catalytique.

Le sous-domaine VIII est essentiel dans la stabilisation de la boucle d’activation afin de former une plateforme pour lier la protéine substrat et permettre l’interaction stabilisant le grand lobe.

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Figure 20: Structure du cœur catalytique des protéines Kinases [191]. Pour exemple est représentée la PKA. A:structure générale en deux lobes. Un petit lobe à l’extrémité Nterminale possédant le site de liaison à l’ATP et au magnésium et un large lobe à l’extrémité Cterminale impliqué dans la reconnaissance de la protéine substrat. A l’interface des deux lobes se situe le site catalytique. B : Segmentation du cœur en sous-domaines I à XI. C : Représentation des motifs hydrophobes R-spine et C-spine [192].

Plus récemment l’étude du mécanisme d’activation des protéines kinases a permis de définir, à l’intérieur du cœur catalytique, des ensembles régulateurs, R-spine et catalytiques, C-spine [192,193]. Par exemple, dans la conformation active de la PKA, le sous domaine VII interagit avec un résidu du lobe C- terminal, une leucine de l’hélice C et un aspartate de l’hélice F du lobe C- terminal. Ces résidus forment un ensemble hydrophobe appelé R-Spine créant un pont entre les deux lobes. Les interactions s’effectuant dans cet ensemble, régulent la conformation de la kinase et en définissent l’état actif ou inactif. L’ensemble des acides aminés du site catalytique des deux lobes, en interaction avec l’ATP est appelé C-spine. En présence d’ATP cet ensemble connecte les deux lobes.

Chaque kinase possède un site de reconnaissance du substrat qui garantit sa spécificité [194,195]. Certaines de ces séquences consensus sont compilées dans le tableau 3. Il est ainsi possible de prédire les sites de phosphorylation possibles et les éventuelles kinases impliquées. De nombreuses séquences consensus ont déjà été identifiées pour de nombreuses kinases [196], mais en ce qui concerne les séquences substrat des kinases de la famille GRK, les choses sont moins claires. Mis à part les séquences substrats de la GRK2 qui ont, très récemment, été étudiées et identifiées [197], les sites consensus de cette famille ne sont pas bien définis.

42 Introduction: Modulation de l’activité des RCPG

Kinase Séquence consensus

Références et revues PKA R-R-X-(S/T)-Φ [198] [196,198] PKC R-(R/F)-R-R-K/R-G-(S/T)-(F/L)-(K/R)-(K/R/Q) [196,198] PKC (F/L)-(K/R)-R-(K/Q)-G-(S/T)-(F/M)-K-K-X-A [196,198] PKC R-R-R-K-(K/G)-(S/T)-F-(K/R)-(K/R)-K-A [196,198] CaMKII R-X-X-(S/T) [196,198]

GRK2 (D/E)X1–3(S/T), (D/E)X1–3(S/T)(D/E), ou (D/E)X0–2(D/E)(S/T) [197] Tableau 3: Séquences consensus de certaines kinases, notamment impliquées dans la désensibilisation des RCPG (d'après [196,197,198]). Les sérines/thréonines phosphorylables sont en gras et entre parenthèses. Entre parenthèse, les acides aminés variables, X représente n’importe quel acide aminé et Φ un acide aminé aromatique.

Des programmes tels que GPS et KinasePhos permettent d’affecter à chaque site possible de phosphorylation un score et de connaitre la ou les kinases impliquées. GPS, par exemple possède une classification hiérarchisée de 408 protéine-kinases humaines. Ces programmes sont des outils utiles dans les premières étapes de l’étude des sites de phosphorylation [199,200,201].

II.1.2

Désensibilisation hétérologue des RCPG par les

kinases AGC

Le groupe des kinases AGC a été nommé d’après les protéines kinases A, G et C [189]. Il compte aujourd’hui 60 protéines kinases dont 42 possèdent en plus du domaine kinase conservé, d’autres domaines fonctionnels d’interaction et de localisation. On trouve dans ce groupe les familles des PKA, PKC et GRK.

II.1.2.1

PKA