5. GMPC ET PDES DANS LES CELLULES CARDIAQUES
5.2 Les phosphodiestérases
a) Les différents types de PDEs
Chez les mammifères, les PDEs sont subdivisées en 11 familles (PDE1-PDE11) (Bender & Beavo, 2006; Conti & Beavo, 2007). Chez l’homme, les PDEs comprennent une superfamille d’isoenzymes issues de β1 gènes. Les sous-familles des PDEs ainsi que les variantes produites par épissage alternatif sont présentées dans le Tableau H6. Certaines familles (PDE2, PDE5, PDE8, PDE9, PDE10, et PDE11) sont les produits d'un seul gène, d’autres (PDE1, PDEγ, PDE4, PDE6, et PDE7) sont les produits de plusieurs gènes. Les PDEs partagent β0 à 50% d’homologie dans les domaines catalytiques (C) formés de ~ β70 acides aminés ; ce nombre augmente au sein des membre d’une même famille (70-80%).
Bien que les membres d'une famille de PDEs partagent de nombreuses similitudes, ils peuvent cependant différer entre elles dans les affinités pour le GMPc et l'AMPc, dans la spécificité aux inhibiteurs et dans les mécanismes de régulation. Il est à noter que parmi ces PDEs, les isoformes 2 et 3 dégradent les deux types de nucléotides cycliques, mais sont en même temps spécifiquement régulés par le GMPc. Ce dernier joue ainsi un double rôle : le substrat et le régulateur. Les propriétés de ces PDEs seront détaillées dans la partie suivante du chapitre.
Les PDE 4, 7 et 8 sont hautement spécifiques pour l'AMPc, tandis que les PDE 5, 6 et 9 sont très spécifiques pour le GMPc. Les autres PDE (PDE 1, 2, 3, 10, et 11) hydrolysent à la fois les deux types de nucléotides cycliques mais avec des rendements différents (Tableau H6, Figure H21) (Bender & Beavo, 2006; Conti & Beavo, 2007). La PDE2 est souvent désignée sous le nom « GMPc-stimulated », mais hydrolyse à la fois les deux nucléotides cycliques avec la même efficacité. De même, la PDE3 est souvent désignée comme la PDE « GMPc- inhibited » (si l'AMPc est le substrat). Cependant, le GMPc constitue également un bon substrat pour la PDE3 (Degerman et al., 1996).
Dans la famille PDE1, PDE1A et PDE1B favorisent significativement le GMPc comme substrat (20:1 et 5:1), tandis que PDE1C utilise l'AMPc et le GMPc avec les mêmes affinité et efficacité (Zhao et al., 1997).
Famille Gène Nb Variantes d'épissage Localisation Chromosomique Substrats Nucléotide Cyclique
Km(μmol/l) Régulation Inhibiteurs
Expression Tissulaire PDE1 PDE1a 12 2q32.1 cAMP 73–120 (+) Ca2+/CaM Vinpocetine (14 μM),
Cerveau, Muscle lisse, Cœur, Testicules cGMP 2.6–5 PDE1b 2 12q13 cAMP 10–24 W-7 (γ00 μM), cGMP 1.2–5.9 (-) PKA, CaMKII PDE1c 5 7p15.1-p14.3 cAMP 0.3–1.2 SCH-51866, cGMP 0.6–2.2 PDE2 PDE2a 4 11q13.4 cAMP 30–50 (+) cGMP, PKC EHNA (1 μM) Cortex surrénal, Cerveau, Cœur cGMP 10–30 (+/-) N-terminal
targeting domain BAY60-7550, Oxindole
PDE3
PDE3a 3 12p12
cAMP 0.02–0.15 (+) PKA, PKB Cilostamide (20 nM), Imazodan, Cœur, Muscle lisse, tissu adipeux, Plaquettes, hépatocytes, cellules pancréatiques cGMP 0.18 (-) cGMP Milrinone (150 nM), Trequinsin, PDE3b - 11p15.1 (+/-) N-terminal targeting domain
Enoximone, Zardaverine (IC50
0.5–β μM), PDE4 PDE4a 11 19p13.2 cAMP 2.9–10 (+) PKA, ERK, Acide Phosphatidique Rolipram (1 μM), RP 7γ401, Ubiquitaire
PDE4b 4 1p31 (-) ERK, Caspases
(+/-) N-terminal targeting domain
Ro 20-17β4 (5 μM),
PDE5 PDE5a 3 4q25-q27 GMPc 1–6.2 (+) GMPc, PKG, PKA (-) Caspases Zaprinast (130 nM), Sildenafil (10 nM), Vardenafil (1 nM), Tadalafil (10 nM), Dipyridamole, T-1032 Muscle lisse, Plaquettes, Cervelet PDE6 PDE6a - 5q31.2-q34 GMPc 15–17 (+) Trasnsducin Zaprinast (400 nM), Rétine PDE6b - 4p16.3 (-) GMPc, and δ subunits Dipyridamole (125 nM), PDE6c - 10q24 Sildenafil (50 nM) PDE7 PDE7a 3 8q13 AMPc 0.1–0.2 (+/-) PKA IBMX (4 μM), dipyridamole (600
nM), Cellules immunitaires, Muscle squelettique, Cœur, Cerveau
PDE7b 4 6q23-q24 BRL50481
PDE8
PDE8a 5 15q25.3
AMPc 0.04–0.06 PAS domain Dipyridamole (9 μM)
Cellules immunitaires, Foie, Reins, Testicules, Thyroïde,
Cœur
PDE8b 6 5q14.1
PDE9 PDE9a 20 21q22.3 GMPc 0.17–0.39 - Zaprinast (γ5 μM), SCH-51866 Cerveau, Reins
PDE10 PDE10a 11 6q26 AMPc 0.26 (-) AMPc Dipyridamole (1 μM), SCH- 51866, Cerveau, Testicules GMPc 7.2 Zaprinast PDE11 PDE11a 4 2q31.2 AMPc 1.04–5.7 - Zaprinast (1β μM), Dipyridamole (0.4 μM), Prostate, Testicules, Muscle squelettique GMPc 0.52–4.2 Tadalafil (60 μM)
Tableau H6 : Les différents types de phosphodiestérases : caractéristiques, localisations, expressions tissulaires, substrats et inhibiteurs. Km : Constante de Michaelis.
Les PDEs ont été trouvées dans toutes les cellules humaines et dans presque tous les compartiments cellulaires : un type particulier de cellules peut contenir des PDEs de plusieurs familles ainsi que des variantes de la même famille. Le profil d'expression des PDEs varie fréquemment avec le développement et l’état prolifératif de la cellule, le type cellulaire et les stimuli (Yan et al., 1996; Rybalkin et al., 1997; Oki et al., 2000; Takahashi et al., 2001; D'Sa
et al., 2002; Shepherd et al., 2004).
Figure H21 : Les différentes structures et domaines d’organisation des phosphodiestérases. Le domaine
catalytique conservé (en rouge) est situé dans la partie C-terminale des phosphodiestérases (PDE). Le domaine catalytique de la PDE3 contient un insert unique de 44 acides aminés (en noir). Plusieurs familles de PDEs contiennent des sous-domaines N-terminaux (domaines GAF, régions UCR, domaines PAS et domaines REC) et des régions hydrophobes N-terminales importantes dans la localisation subcellulaire, dans l’interaction avec des molécules de signalisation et dans la régulation de l'activité des PDEs. CaMKII : calcium/calmoduline-dépendante protéine kinase II; ERK2 : « extracellular signal-regulated kinase 2 »; PKA : protéine kinase AMPc-dépendante; Pat7 : 7-résidus signal de localisation nucléaire. D’après Maurice et al., 2014.
La concentration cellulaire des PDEs est estimée comme étant assez faible puisque ces PDEs montrent un taux catalytique très élevé afin de maintenir les niveaux de nucléotides cycliques dans la gamme physiologique désirée. Toutefois, dans certains types cellulaires, les concentrations de PDEs peuvent être très élevées : par exemple dans les cellules photoréceptrices de la rétine (10-50 μM de PDE6) (Cote, 2006), ou au niveau du corps caverneux du pénis et au niveau des poumons (~ 0,1 μM de PDE5) (Gopal et al., 2001; Corbin, 2005).
L’abondance relative peut imposer des restrictions assez importantes sur l'action des inhibiteurs des PDEs. Dans certains cas, le faible niveau d'une PDE dans un tissu peut être important physiologiquement et pharmacologiquement.
b) Les PDEs 2 et 3 (GMPc-dépendantes)
Plusieurs PDEs dégradent spécifiquement le GMPc, l’AMPc ou les deux nucléotides cycliques comme préalablement mentionné. Parmi ces PDEs, les isoformes 2 et 3 qui sont spécifiquement régulées par le GMPc.
- Phosphodiestérase 2
La localisation génomique, l’expression tissulaire, les substrats et les différents inhibiteurs de la PDE2 sont présentés dans le Tableau H6. La PDE2 hydrolyse le GMPc et l'AMPc avec une affinité et une efficacité approximativement équivalentes, et se lie aux nucléotides cycliques sur des sites allostériques (Martinez, 2006). A ce titre, la PDE2 est souvent décrite comme « cGMP-stimulated cAMP PDE ». L'affinité du site allostérique pour le GMPc est ~10 fois plus importante que pour l'AMPc. Mais le taux cellulaire d'AMPc est généralement beaucoup plus élevé que le GMPc de sorte que l’AMPc peut occuper le site allostérique de la PDE2 et accélérer ainsi la dégradation des nucléotides cycliques (Wu et al., 2004).
Par conséquent, il semble probable que l'interaction de l'AMPc ou du GMPc avec le site allostérique pourrait favoriser une activité accrue du site catalytique envers l’un ou l’autre des nucléotides cycliques, médiant ainsi un rétrocontrôle négatif et/ou un « cross-talk ». Un exemple de « cross-talk » est observé dans les cellules glomérulaires surrénales : lorsque les concentrations de GMPc dans ces cellules sont élevées (en réponse par exemple à l’ANP), le GMPc se lie aux sites allostériques de la PDEβ et active l'enzyme afin d’augmenter la dégradation de l’AMPc et de diminuer ainsi la production d'aldostérone (MacFarland et al., 1991).
Dans les cardiomyocytes, le niveau de PDE2 est contrôlé par PDE2 (membrane plasmique) et PDE3 (cytosol) (Figure H22) (Castro et al., 2006). Dans les deux cas, l'élévation du taux de GMPc pourra prédire une augmentation de la fixation du GMPc aux sites allostériques des deux PDEs, entraînant une augmentation de l'activité du site catalytique et l'activation d'une voie de rétrocontrôle négatif.
Figure H22 : Régulation du rétrocontrôle négatif de la signalisation GMPc via PDE2 et PDE5 dans le
cardiomyocyte. La synthèse du GMPc est augmentée lorsque les premièrs messagers (peptides natriurétiques, monoxyde d’azote) stimulent l'activité catalytique des cyclases. GMPc se lie aux sites de régulation des PDE2 et PDE5 (R domains). Cette interaction augmente l'affinité de ces enzymes pour le GMPc au niveau de leurs sites catalytiques, augmente la dégradation du GMPc et régule le rétrocontrôle négatif. Enfin, le GMPc active la PKG, entraînant la phosphorylation de protéines cellulaires qui provoquent les effets physiologiques du GMPc. Modifiée d’après Francis et al., 2009.
- Phosphodiestérase 3
La PDE3 hydrolyse à la fois l'AMPc et le GMPc. Mais la dégradation de l'AMPc peut être inhibée par le GMPc, le taux d'hydrolyse maximale (Vmax) de la PDE3 étant 10 fois plus
faible pour le GMPc que pour l'AMPc. Le GMPc peut agir ainsi comme un inhibiteur compétitif de l'AMPc. De ce fait, la PDE3 est dénommée « cGMP-inhibited PDE » (Corbin et
al., 1985; Degerman et al., 1990).
PDE3a et PDE3b sont les isoformes de la sous-famille de PDE3. Les deux présentent une forte affinité pour l'AMPc et GMPc.
Il a été rapporté que l'expression de la PDE3a est modifiée dans l'insuffisance cardiaque. En effet, dans le cœur humain insuffisant ou dans le cœur de souris soumis à une surcharge de pression chronique, une diminution de l’expression de la PDEγa a été observée, due à l’apoptose accrue des cardiomyocytes (Ding et al., 2005a). De plus, le traitement à l'angiotensine II et à l'isoprotérénol pourrait réguler négativement l'expression de PDE3a et favoriser une surexpression de ICER (inductible cAMP early repressor) dans les myocytes
cardiaques (Ding et al., 2005a). De ce fait, une hypothèse selon laquelle un mécanisme d'autorégulation positive existerait dans la boucle de rétrocontrôle PDE3a-ICER a été postulée (Ding et al., 2005b). En outre, PDE3a joue un rôle important dans le phénotype et la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (Eckly-Michel et al., 1997; Maurice et al., 2003; Nishioka et al., 2011). Récemment, Begum et al. en 2011 ont montré que la PDE3a régule la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires via l’inhibition des MAP Kinases. Finalement, il a aussi été montré que l'expression de PDE3a est régulée négativement dans le phénotype sécrétoire par rapport au phénotype contractile (Dunkerley et al., 2002).
Concernant la PDE3b, elle est phosphorylée et activée par la PKA (suite à une activation AMPc-dépendante). Des études ont montrées que le « Peroxisome proliferator-activated receptor » est nécessaire pour l'expression de PDEγb, qui est surexprimé au cours de la différenciation en adipocytes dans des cellules 3T3-L1 (Ogura et al., 2003). Récemment, il a été rapporté que l'interaction de la PDE3b avec PI3K est importante pour la régulation négative de la contractilité cardiaque (Patrucco et al., 2004). La localisation génomique, l’expression tissulaire, les substrats et les différents inhibiteurs de la PDE3 sont présentés dans le Tableau H6.
c) Rôle des PDEs
La PDE hydrolyse, par insertion d'un dérivé hydroxyle au niveau du phosphore de l'anneau de phosphate cyclique unique à l'AMPc et au GMPc (Figure H23). Le produit de cette réaction, 5'-AMP ou 5'-GMP, est inactif. Cette hydrolyse peut impliquer des PDEs hautement spécifiques pour l'AMPc ou le GMPc, mais aussi des PDEs non spécifiques.
Figure H23 : Structure des nucléotides cycliques et site d’action des PDEs. Modifiée d’après Beavo &
Brunton, 2002.
Les PDEs sont régulées par de nombreux processus, tels que les taux intracellulaires d’AMPc et de GMPc, leurs taux d’expression et les interactions avec d'autres protéines telles que la calmoduline, la transducine, le récepteur de la PKC, les -arrestines et les tyrosine kinases. L’intégration de ces signaux module les activités catalytiques des PDEs et permet ainsi d’établir :
Un rétrocontrôle négatif des niveaux des nucléotides cycliques dans de nombreuses cellules Un «cross-talk » entre les différentes voies de signalisation
Une régulation de l'intensité et de la durée de la réponse cellulaire à des stimuli externes. La détermination des fonctions exactes de chaque PDE reste une tâche complexe puisque plusieurs de leurs propriétés catalytiques se chevauchent. Toutefois en dépit de ce croisement des fonctions des PDEs dans une même cellule, une compartimentation subcellulaire existe (Fischmeister et al., 2005; Fischmeister et al., 2006). La compartimentation est responsable, en partie, de la création de micro-domaines qui limitent l'espace de diffusion des nucléotides cycliques et accentuent ainsi la sélectivité de leurs cibles (Houslay & Milligan, 1997; Rich et
al., 2001; Baillie et al., 2003; Barnes et al., 2005). d) Pharmacologie des PDEs
L’inhibition des différentes formes de phosphodiesterases, de manière sélective et par une variété de médicaments, a été montrée d’abord dans le cerveau et dans bien d'autres tissus (Weiss, 1975; Fertel & Weiss, 1976). L’utilisation des inhibiteurs sélectifs des
a servie de base pour différents autres travaux ciblant plusieurs objectifs thérapeutiques (iPDEγ dans l’insuffisance cardiaque, iPDE4 dans l’inflammation, iPDE5 dans le dysfonctionnement érectile, etc.)
Deux types d’inhibiteurs ont été identifiés : des inhibiteurs non sélectifs comme l’IBMX (γ-isobutyl-1-methylxanthine), la paraxanthine, la pentoxifylline et la théophylline, et des inhibiteurs sélectifs à chaque famille de PDEs. Nous allons discuter, dans ce qui suit, les inhibiteurs spécifiques des familles PDE3 et PDE2.
Les inhibiteurs sélectifs de la famille des PDE3 (Cilostazol, enoximone et milrinone) : Ils ont été développés dans l'optique d’améliorer la fonction cardiaque chez l'homme en augmentant l’inotropisme et la chronotropisme (Packer et al., 1991; Amsallem et al., 2005). Les différents inhibiteurs de la PDE3 sont présentés dans le Tableau H6. Ces agents pharmaceutiques inhibent aussi l'agrégation plaquettaire (Kambayashi et al., 2003) et diminuent la post-charge cardiaque en améliorant la relaxation artérielle (Maurice et al., 2003). En raison de leur double effet sur le cœur et les vaisseaux, ils sont appelés «inodilatateurs» (Endoh & Hori, 2006).
Vus leurs effets inotropes positifs, les inhibiteurs de la PDE3 ont été initialement proposés pour le traitement de l'insuffisance cardiaque, mais le traitement chronique s’est avéré non bénéfique avec une augmentation du risque de mort subite (Packer et al., 1991; Osadchii, 2007). L'existence de modèles de souris knockout (PDE3a -/- (Masciarelli et al., 2004) et PDE3b -/- (Choi et al., 2006) offre aujourd’hui de nouvelles pistes pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire à l’origine des effets secondaires cardiovasculaires, associés à l'utilisation de inhibiteurs de la PDE3. De ce fait, il est important de reconnaître que la contribution de PDEγ à l'activité totale de l'AMPc /GMPc dans le cœur de la souris est de ± 30% (Georget et al., 2003), et est similaire à sa représentation dans le cœur humain (Reeves et al., 1987; Bethke et al., 1991; von der Leyen et al., 1991; Richter et al., 2011). Il est à noter que l'activité absolue de la PDE3 est environ cinq fois plus élevée dans le myocarde humain que celui de la souris (Richter et al., 2011).
Les inhibiteurs sélectifs de la PDE2 (EHNA, BAY60-7550 et oxindol) :
Le premier inhibiteur de PDE2 disponible fut EHNA. Il fut découvert en 1992 (Podzuweit
et al., 1995) et présente une faible affinité (IC50 de 800 nM). Récemment, Bayer a
et PDP (9-6-phényl-2-oxohex-3-yl) -2- (3,4-diméthoxybenzyl)-purine-6-one) (IC50 = 0,6
nM) (Seybold et al., 2005). La PDE2 est impliquée dans la régulation de nombreux processus intracellulaires, à savoir la sécrétion d'aldostérone, la modulation des concentrations intracellulaires d'AMPc et du GMPc dans les plaquettes et dans les neurones (Hepp et al., 2007), et la modulation du courant calcique de type L dans le cœur (Fischmeister et al., 2005).
POSITION DU PROBLEME
On estime à 17.3 millions le nombre de décès attribués aux maladies cardio- vasculaires, d’après les chiffres de l’organisation mondiale de la santé, soit près de γγ% de la mortalité mondiale totale. Ce nombre rend les pathologies cardiaques l’une des premières cause de décès chez l’homme. La compréhension de ces pathologies et de leurs origines est essentielle pour essayer de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les fibroblastes, la composante cellulaire majoritaire du cœur humain, ont longtemps été considérés comme n’assurant qu’un rôle de soutien dans le cœur. Toutefois, les études ont montré que ces cellules sont impliquées dans des processus qui peuvent influencer le fonctionnement cardiaque. Ainsi leurs propriétés sécrétoires et prolifératives les placent à la base du renouvellement de la matrice extracellulaire (MEC). Des travaux menés sur les fibroblastes ont révélé une implication primordiale de ce type cellulaire non seulement en physiologie mais aussi en physiopathologie. En effet, il est proposé que ces cellules puissent communiquer avec les cellules musculaires du cœur et donc réguler les propriétés de conduction électrique et les propriétés mécaniques au sein de l’organe.
Cependant, l'hyperactivité des fibroblastes cardiaques en réponse à de nombreux stimuli environnementaux est associée à des modifications phénotypiques qui se traduisent par leur différenciation en myofibroblastes. L’altération de leurs propriétés sécrétoires et prolifératives contribuent à la fibrogenèse cardiaque. En parallèle, l’existence de systèmes cardiaques hormonaux confère au cœur la propriété de participer à l’homéostasie. Les peptides natriurétiques ont longtemps été investigués pour leurs propriétés cardioprotectrices, mais récemment les études ont proposé un rôle potentiel de ces hormones dans la régulation des propriétés fibroblastiques cardiaques. Ces études ont permis d’entamer de nouvelles thématiques ciblant la fibrose et le remodelage cardiaque à travers ce système.
Des travaux ont suggéré que la régulation de la formation de la matrice extracellulaire participe aux effets locaux antifibrotiques des peptides natriurétiques. Cependant, la régulation de la différentiation des fibroblastes cardiaques en conditions pathologiques impliquant le peptide natriurétique atrial (ANP), ses récepteurs (NPR) et le GMP cyclique reste peu connue. La modulation des propriétés antifibrotiques de l’ANP nécessite une analyse fonctionnelle de
son effet au sein des fibroblastes cardiaques. C’est cet objectif global que nous avons choisi de suivre dans ce travail. Nous allons, dans un premier temps, étudier l’implication de ce peptide dans la différenciation fibroblastique via des outils expérimentaux ciblant l’analyse des propriétés sécrétoires, migratoires et prolifératives. La reconnaissance de l’impact de l’ANP sur les fibroblastes cardiaques impliquera, en second lieu, la détermination des récepteurs impliqués dans ce processus par une analyse génomique et protéomique et les voies de signalisations intracellulaires sollicitées. Ce projet s’attachera également à étudier les canaux ioniques qui peuvent réguler le fonctionnement des fibroblastes cardiaques. Pour l’instant, les études n’ont pas déterminé le rôle de ce peptide sur ces canaux que nous essayerons d’évaluer. Nous proposons qu’une meilleure perception du rôle cardioprotecteur antifibrotique de l’ANP sur les propriétés et les fonctions des fibroblastes cardiaques permettra une meilleure compréhension de ses effets dans la fibrose et le remodelage cardiaque.