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Étude des effets du peptide natriurétique atrial sur les fibroblastes : implication physiopathologique dans le remodelage cardiaque

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Academic year: 2021

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Texte intégral

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Pour l'obtention du grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS UFR des sciences fondamentales et appliquées

Laboratoire Signalisation et transports ioniques membranaires - STIM (Poitiers) (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)

École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)

Secteur de recherche : Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie Cotutelle : Université Saint-Joseph (Beyrouth)

Présentée par : Majed Moubarak

Étude des effets du peptide natriurétique atrial sur les fibroblastes :

implication physiopathologique dans le remodelage cardiaque Directeur(s) de Thèse :

Jean-François Faivre, Nassim Farès Soutenue le 08 décembre 2014 devant le jury

Jury :

Président Roland Tomb Professeur, Université Saint Joseph de Beyrouth Rapporteur Romain Guinamard Professeur des Universités, Université de Caen Rapporteur Ramez Chahine Professeur, Université Libanaise de Beyrouth Membre Jean-François Faivre Professeur des Universités, Université de Poitiers Membre Nassim Farès Professeur, Université Saint Joseph de Beyrouth Membre Patrick Bois Professeur des Universités, Université de Poitiers Membre Victor Jebara Professeur, Université Saint Joseph de Beyrouth

Pour citer cette thèse :

Majed Moubarak. Étude des effets du peptide natriurétique atrial sur les fibroblastes : implication

physiopathologique dans le remodelage cardiaque [En ligne]. Thèse Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie.

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UNIVERSITE SAINT-JOSEPH - FACULTE DE MEDECINE

UNIVERSITE DE POITIERS - FACULTE DES SCIENCES

FONDAMENTALES ET APPLIQUEES

THESE DE DOCTORAT

OPTION: Physiologie et physiopathologie

(Ecole Doctorale Sciences et Santé, USJ)

Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

(Ecole Doctorale Bio-santé, UP)

Sujet de la thèse :

Etude des effets du peptide natriurétique atrial sur les fibroblastes:

Implication physiopathologique dans le remodelage cardiaque

Présentée par :

MOUBARAK Majed

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE SAINT-JOSEPH ET DE

L’UNIVERSITE DE POITIERS

Soutenue le 8 Décembre 2014

Devant le jury composé de :

Pr. Roland Tomb

Président

Pr. Romain Guinamard

Rapporteur

Pr. Ramez Chahine

Rapporteur

Pr. Victor Jebara

Examinateur

Pr. Patrick Bois

Examinateur

Pr. Nassim Fares

Directeur de thèse

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Remerciements

Et voilà cette thèse qui s’achève après plus de 3 ans passés entre le laboratoire de recherche en Physiologie et Physiopathologie de l’Université Saint-Joseph et le laboratoire PPCI devenu récemment TIRC de l’Université de Poitiers.

Je commence mes remerciements par la faculté de médecine de l’USJ, en la personne de son doyen le Professeur Roland Tomb, qui m’a fait l’honneur également d’être présent au sein du jury.

Je souhaite remercier le Professeur Fréderic Becq pour m’avoir accueillie au sein de l’Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires de l’Université de Poitiers, devenu STIM après la restructuration sous sa direction.

Je remercie également le conseil de recherche de l’USJ et la Fondation France qui m’ont soutenu financièrement durant mes séjours en France.

Mes remerciement aux Professeurs Romain Guinamard, Ramez Chahine et Victor Jebara qui m’ont fait l’honneur de juger et examiner ce travail de thèse.

Je ne pourrai pas continuer mes remerciements avant d’exprimer ma gratitude à mes directeurs de thèse. Au Pr Nassim Fares qui m’a soutenu tout au long du travail et n’a cessé de m’encourager. C’est votre passion de la physiologie qui m’a attiré et attaché à ce domaine. Au Pr. Jean-François Faivre, je vous remercie pour votre aide personnelle et professionnelle tout au long de mes séjours poitevins, pour ce côté professionnel exceptionnel et pour m’avoir former au Patch Clamp et à l’utilisation de « l’étireuse horizontale »... A vous mes plus profondes gratitudes et remerciements.

Merci aux membres de l’équipe TIRC qui pour moi restera l’équipe « Cœur ». Au Pr. Patrick Bois, pour avoir accepter d’examiner ce travail et pour votre aide et vos conseils, sans oublier les bons moments « Libanais ». Au Dr. Aurélien Chatelier ou « Dr. Chatelier » à qui je me rendais quand j’avais un problème d’ordre scientifique. Au Dr. Jocelyn Bescond, notre présentateur de la marque Eden Park et mon voisin de bureau durant ma première année, pour nos échanges scientifiques. A Mr. Christophe Magaud qui était toujours prêt à me répondre à n’importe quelle question et à faire passer mes commandes… Merci l’Ami… Nos discussions vont me manquer !! Mes remerciements à Mme Claudine Descombes pour son aide technique et Mr. Grégoire Carré pour son calendrier mensuelle de l’utilisation de la salle Langendorff, Je vous souhaite le meilleur dans votre vie future. Egalement je remercie le reste de l’équipe TIRC : Dr.

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pour l’avenir.

Je remercie les membres du laboratoire de recherche en Physiologie et Physiopathologie pour les bons moments passés ensemble et les nombreux gateaux : Dr. Youakim Saliba, Mlle Joelle Hajal, Mlle Sarah Rouhana et Mr. Hrag Oskeridjian.

De l’équipe TIM ou « Muco », merci au Dr. Caroline Norez et Mme Mathilde Jollivet pour leur aide dans la réalisation des expérimentations d’efflux et à Mme Sandra Mirval pour son aide technique et son humour incontestable!

Merci également au Dr. Anne Cantereau et au Pr. Georges Aftimos pour leur aide appréciée.

Merci aux personnels techniques Messieurs James Habrioux et Yves Lebourg, et aux personnels administratifs Mesdames Lalasoa Raynaud, Carole Desfontaines et Christelle Morillon qui ont tous contribué au bon déroulement de ma thèse.

Merci à tous les stagiaires, thésards et docteurs qui ont passé dans le laboratoire durant mes années de thèse : Mr. Pierre Bobin, Mr. Maxime Branchereau, Mr. Boris Tremblier, Dr. Thomas Pambrun et Mlle Mélanie Gueffier. Sans oublier les ami(e)s Dr. Coralie Lamiche, Dr. Jonathan Clarhaut, Mme Sandrine Charreau, Dr. Sylvain Fraineau et Dr. Arnaud François. Je vous souhaite tous plein de succès dans votre vie personnelle et professionnelle.

A Mme Dr. Aurélie Monique Mercier François un très grand merci pour tous ces moments passés ensemble. Je te souhaite le meilleur pour ton projet future avec Arnaud et les deux poupettes. Au Dr. Rania Harisseh, ma première amie Libano-Poitevine, merci pour avoir été là quand j’avais besoin de parler et de « râler »…

Aux amis Ziad Sadaka et Nour Moujaes, merci d’avoir été à mes côtés durant toutes ces années. Merci à Joelle Jandry, Soumaya Hamieh, Ghizlane Abdelli et Sarah Karam pour tous les moments passés ensemble… Je vous souhaite le meilleur mes chères docteurs ! Au « Dr. » Raëd Farhat, merci pour les longues discussions et les longues soirées. Tu sais bien que je ne te souhaite que le meilleur dans ton projet avenir… Au futur Dr. Pamela Abdallah, merci pour avoir été à mes côtés durant cette longue dernière année et de m’avoir soutenu durant les hauts et les bas.

Enfin je remercie ma famille et mes parents qui m’ont tant soutenu, cru en moi, encouragé sans cesse et qui sans eux je n’aurai pas accompli tout ce que j’ai accompli jusqu'à maintenant…

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Résumé

Le peptide natriurétique atrial ou ANP est une hormone cardiaque libérée lors de l'insuffisance cardiaque et agit comme un régulateur de la matrice extracellulaire (MEC). Les fibroblastes cardiaques, responsables de la synthèse des composants de la MEC, acquièrent dans les conditions pathologiques la capacité de se différencier en myofibroblastes, conduisant ainsi à une fibrose cardiaque. Les mécanismes de régulation impliquant l’ANP et ses récepteurs (NPR) restent peu connus et font l’objet de ce travail. Les fibroblastes ventriculaires ont été isolés à partir de cœurs de rats Wistar et mis en culture afin d'induire leur différenciation. Les cultures ont ensuite été soumises à différents traitements impliqués dans la voie ANP/NPR. L’ANP diminue le taux de prolifération, la migration cellulaire, et la sécrétion de collagène des myofibroblastes. Cet effet est mimé par le 8-Br-GMPc. L’analyse protéomique et génomique a permis de confirmer la présence des récepteurs natriurétiques A et B dans nos cellules. Par ailleurs, l’expression de dix isoformes de phosphodiestérases dans les myofibroblastes a été révélée par un criblage génomique. L’inhibition non sélective de ces phosphodiestérases provoque une diminution de la prolifération et de la sécrétion de collagène. Enfin, les concentrations intracellulaires de GMPc et d’AMPc ont été trouvées augmentées en présence de l'ANP. En parallèle, la caractérisation des courants ioniques présents sur les myofibroblastes a montré une absence des courants sodique rapide et potassique ATP-dépendant. Cette étude montre le rôle de la voie ANP/NPR/GMPc dans la modulation des propriétés fibroblastiques et illustre la complexité des processus de différenciation cellulaire au cours de la fibrogenèse cardiaque.

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Abstract

Atrial natriuretic peptide or ANP is a cardiac hormone released during heart failure and acts as a regulator of the extracellular matrix (ECM). Cardiac fibroblasts are responsible for the synthesis of ECM components and acquire under pathological conditions the capacity to differentiate into myofibroblasts, leading to cardiac fibrosis. Regulatory mechanisms involving ANP and its receptors (NPR) are poorly known and make the subject of our work. Ventricular fibroblasts were isolated from Wistar rat hearts and cultured to induce differentiation. The cultures were then subjected to various treatments involved in the ANP/NPR pathway. ANP decreases the proliferation rate, cell migration and collagen secretion. This effect was mimicked by 8-Br-cGMP. In addition, genomic and proteomic analysis confirmed the presence of the natriuretic receptor A and B in our cells. Furthermore, the expression of ten phosphodiesterases isoforms in the myofibroblasts was revealed by genomic screening. The non-selective inhibition of these phosphodiesterases causes a decrease in the proliferation and secretion of collagen. Finally, the intracellular concentrations of cAMP and cGMP were increased in the presence of ANP. In parallel, the characterization of ionic currents present in myofibroblasts revealed the absence of rapid sodium and potassium ATP-dependent currents. This study shows the role of the ANP/NPR/cGMP pathway in modulating fibroblast properties and exposes the complexity of the cell differentiation process during cardiac fibrogenesis.

(7)

Table des matières

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 1

1. LE CŒUR : DE LA MORPHOLOGIE A LA FONCTION ... 1

1.1 CELLULES MYOCYTAIRES ET NON MYOCYTAIRES ... 1

1.2 AUTOMATISME ET CONDUCTION ... 2

1.3 COUPLAGE EXCITATION-CONTRACTION ... 3

1.4 COUPLAGE EXCITATION-TRANSCRIPTION ... 5

1.5 FONCTION ENDOCRINE ... 6

2. LES FIBROBLASTES ET MYOFIBROBLASTES CARDIAQUES ... 8

2.1 PROPRIETES PHENOTYPIQUES ... 8

2.1.1 Origine ... 9

2.1.2 Morphologie ... 11

2.1.3 Marqueurs des fibroblastes ... 12

2.1.4 Ultrastructure ... 14

2.1.5 Le myofibroblaste ... 14

a) Transdifférenciation du fibroblaste en myofibroblaste ... 15

b) Place des myofibroblastes dans le cœur ... 16

2.2 PROPRIETES ELECTROPHYSIOLOGIQUES ... 17

2.2.1 Canaux sodiques ... 18

2.2.2 Canal potassique rectifiant entrant (inward rectifier K+ channels : Kir) ... 19

2.2.3 Canaux chlorure ... 20

2.2.4 Canaux protons ... 21

2.2.5 Autres canaux ... 21

a) Canaux TRP ... 22

b) Echangeurs ... 22

c) Le courant potassique rectifiant retardé ... 23

d) Le courant potassique transitoire sortant : Ito ... 24

e) Les canaux potassiques Ca2+ dépendants (BKCa) ... 24

2.3 PROPRIETES FONCTIONNELLES ... 25

2.3.1 Formation de la matrice extracellulaire ... 25

2.3.2 Sécrétion de cytokines ... 26

a) Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α): ... 26

b) Interleukine 1 (IL-1) : ... 28 c) Interleukine 6 (IL-6): ... 28 2.4 COMMUNICATION INTERCELLULAIRE ... 29 2.4.1 Fibroblaste-Fibroblaste ... 29 2.4.2 Fibroblaste-cardiomyocyte ... 30 3. LA FIBROSE CARDIAQUE ...33 3.1 DEFINITION ... 33 3.2 ETIOLOGIE ... 35 3.3 MECANISMES DE LA FIBROSE ... 35

a) La TGF- (Transforming growth factor ) ... 36

b) Les thrombospondines (TSPs) ... 39

c) La ténascine C ... 39

d) L’Ostéopontine (OPN)/SPARC ... 40

(8)

4. LES PEPTIDES NATRIURETIQUES ET LEURS RECEPTEURS ...41

4.1 LE PEPTIDE NATRIURETIQUE DE TYPE A (ANP) ... 42

4.1.1 Synthèse et sécrétion ... 42

4.1.2 Expression génomique ... 46

4.1.3 Effets physiologiques ... 47

4.2 LE PEPTIDE NATRIURETIQUE DE TYPE B (BNP) ... 47

4.3 LE PEPTIDE NATRIURETIQUE DE TYPE C (CNP) ... 49

4.4 AUTRES PEPTIDES NATRIURETIQUES ... 50

a) Le peptide natriurétique de type D (DNP) ... 50

b) Le peptide natriurétique de type V (VNP) ... 50

4.5 LES PEPTIDES NATRIURETIQUES COMME OUTILS THERAPEUTIQUES ... 51

4.5.1 ANP ... 51

4.5.2 BNP ... 51

4.5.3 CNP ... 52

4.6 LES RECEPTEURS DES PEPTIDES NATRIURETIQUES ... 52

4.6.1 Récepteurs guanylate cyclase ... 52

4.6.2 Récepteur natriurétique de type A (NPR-A) ... 55

4.6.3 Récepteur natriurétique de type B (NPR-B) ... 57

4.6.4 Récepteur natriurétique de type C (NPR-C) ... 58

5. GMPC ET PDES DANS LES CELLULES CARDIAQUES...60

5.1 VOIES DE SIGNALISATION GMPC-DEPENDANTES ... 60

5.2 Les phosphodiestérases ... 64

a) Les différents types de PDEs ... 64

b) Les PDEs 2 et 3 (GMPc-dépendantes) ... 68

c) Rôle des PDEs ... 70

d) Pharmacologie des PDEs ... 71

POSITION DU PROBLEME ...74

MATERIELS ET METHODES ...76

1. DISSOCIATION ET CULTURE CELLULAIRES : ISOLEMENT DES FIBROBLASTES CARDIAQUES DE RAT ADULTE ...76

2. MESURE DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE: TEST MTT ...79

2.1 PRINCIPE ... 79

2.2 PROTOCOLE ... 80

3. ETUDE DES PROPRIETES DE SECRETION CELLULAIRE ET DES CONCENTRATIONS INTRACELLULAIRES DE NUCLEOTIDES CYCLIQUES ...80

3.1 DOSAGE DE LA SECRETION DU COLLAGENE PAR LE KIT SIRCOL ASSAY ... 80

3.1.1 Principe ... 80

3.1.2 Protocole ... 81

3.2 MESURE DE LA SECRETION D’IL-6, DE LA CONCENTRATION INTRACELLULAIRE EN CGMP ET DE LA CONCENTRATION INTRACELLULAIRE EN CAMP PAR LA TECHNIQUE ELISA ... 81

3.2.1 Principe ... 81

3.2.2 Protocole du dosage de sécrétion d’IL-6 par les fibroblastes cardiaques ... 83

3.2.3 Protocole ELISA GMPc ... 84

(9)

4.1 PRINCIPE ... 85

4.2 PROTOCOLE ... 85

5. TECHNIQUES DE FLUORESCENCE ...86

5.1 PRINCIPE D’IMMUNOMARQUAGE ... 86

5.2 PROTOCOLE D’IMMUNOFLUORESCENCE: IDENTIFICATION DE L’EXPRESSION DES RECEPTEURS NATRIURETIQUES NPRA ET NPRB ... 86

5.3 PROTOCOLE D’IMMUNOCYTOCHIMIE: IDENTIFICATION DE L’EXPRESSION DE LA VIMENTINE, L’Α -SMA ET LE CD31 ... 87

6. TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET DE BIOCHIMIE ...88

6.1 « REVERSE TRANSCRIPTION-POLYMERASE CHAIN REACTION » (RT -PCR) ET PCR QUANTITATIVE PAR SYBRGREEN ... 88

6.1.1 Principe ... 88

6.1.2 Protocole d’extraction d’ARN ... 88

6.1.3 Protocole de la transcription inverse en ADN complémentaire (ADNc) ... 89

6.1.4 « Quantitative Real – Time PCR » par SybrGreen ... 89

6.2 EXTINCTION DE L’EXPRESSION DES GENES NPRA/NPRB DANS LES FIBROBLASTES CARDIAQUES PAR ARN D’INTERFERENCE... 92

6.2.1 Principe ... 92 6.2.2 Protocole ... 93 6.3 WESTERN BLOT ... 93 6.3.1 Principe ... 93 6.3.2 Extraction protéique ... 93 6.3.3 Protocole d’immunoblot ... 94

7. MESURE DE L’ACTIVITE DU CANAL CHLORE CALCIUM DEPENDANT : TECHNIQUE DU FLUX D’IODURE (RADIO-IOSOTOPE 125 I) ...96

7.1 PRINCIPE ... 96

7.2 PROTOCOLE ... 96

8. TECHNIQUE D’ELECTROPHYSIOLOGIE : LE PATCH-CLAMP ...98

8.1 PRINCIPE ... 98

8.2 DISPOSITIF EXPERIMENTAL ... 98

8.3 LES CONFIGURATIONS D’ENREGISTREMENTS ... 99

8.4 LES SOLUTIONS ... 101

9. TRAITEMENTS DES DONNEES ET ANALYSES STATISTIQUES ... 102

RESULTATS ... 103

1. DIFFERENCIATION DU FIBROBLASTE CARDIAQUE DE RAT EN MYOFIBROBLASTE .... 103

2. LES EFFETS DU PEPTIDE NATRIURETIQUE ATRIAL (ANP) SUR LES FIBROBLASTES CARDIAQUES DE RAT EN CULTURE ... 105

2.1 EFFET DE L’ANP SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE... 105

2.2 EFFET DE L’ANP SUR LA SECRETION DE COLLAGENE ... 106

2.3 EFFET DE L’ANP SUR LA SECRETION DE L’INTERLEUKINE-6 (IL-6) AU COURS DE LA DIFFERENCIATION ... 107

2.4 EFFET DE L’ANP SUR LA MIGRATION CELLULAIRES DES FIBROBLASTES CARDIAQUES ... 108 3. LES EFFETS DE L’ANP SUR LES FIBROBLASTES CARDIAQUES EN PRESENCE DE

(10)

3.1 EFFET DE L’ANP EN PRESENCE DE L’ANGII SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE ... 110

3.2 EFFET DE L’ANP EN PRESENCE DE L’ANGII SUR LA SECRETION DE COLLAGENE... 111

4. LA LOCALISATION DES RECEPTEURS DES PEPTIDES NATRIURETIQUES (NPRS) SUR LES FIBROBLASTES CARDIAQUES DE RAT EN CULTURE ... 112

4.1 ETUDE DE L’EXPRESSION DES GENES NPRA ET NPRB PAR RT-QPCR ... 112

4.2 ETUDE DE L’EXPRESSION PROTEIQUE DES RECEPTEURS NPRS ... 113

4.3 ETUDE DE L’EXPRESSION DES RECEPTEURS NPRS PAR IMMUNOMARQUAGE ... 114

5. L’INHIBITION DES RECEPTEURS NPRS SUR DES CULTURES DE FIBROBLASTES CARDIAQUES DE RAT ... 116

5.1 EXPRESSION DES GENES NPRA ET NPRB PAR RT-QPCR ... 116

5.2 ETUDE DES PROPRIETES DE PROLIFERATION ET DE SECRETION EN PRESENCE DES SIRNA ... 117

6. LES EFFETS FONCTIONNELS DU GMP CYCLIQUE SUR LES FIBROBLASTES CARDIAQUES DE RAT EN CULTURE ... 119

6.1 EFFET DU 8-BR-CGMP SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE ... 119

6.2 EFFET DU 8-BR-CGMP SUR LA SECRETION DE COLLAGENE ... 120

7. PROFIL DES PHOSPHODIESTERASES DANS LES FIBROBLASTES CARDIAQUES DE RAT EN CULTURE : IDENTIFICATION DES PDES AMPC ET GMPC-DEPENDANTES PAR RT-QPCR 121 8. L’INHIBITION DES PHOSPHODIESTERASES ET LEUR IMPACT SUR LES PROPRIETES DES FIBROBLASTES CARDIAQUES EN CULTURE ... 123

8.1 EFFET DE L’ANP SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE EN PRESENCE DE L’IBMX ... 123

8.2 EFFET DE L’ANP SUR LA SECRETION DE COLLAGENE EN PRESENCE DE L’IBMX ... 125

9. LE DOSAGE DES NUCLEOTIDES CYCLIQUES INTRACELLULAIRES : AMPC ET GMPC .. 126

9.1 DOSAGE DU GMP CYCLIQUE INTRACELLULAIRE ... 126

9.2 DOSAGE DE L’AMP CYCLIQUE INTRACELLULAIRE ... 129

10. L’EFFET DE L’ANP SUR DES GENES REGULATEURS DES FIBROBLASTES CARDIAQUES 130 11. L’ETUDE DE L’ACTIVITE DU CANAL CHLORURE CALCIUM- DEPENDANT SUR LES FIBROBLASTES CARDIAQUES EN CULTURE PAR LA TECHNIQUE DE L’EFFLUX D’IODURE 132 11.1 DOSAGE DE L’ACTIVITE DU CANAL EN FONCTION DES JOURS DE CULTURE ... 133

11.2 EFFET DE L’ANP SUR L’ACTIVITE DU CANAL ... 134

12. EXCITABILITE DES (MYO)FIBROBLASTES VENTRICULAIRES ... 135

12.1 ANALYSE DE L’ACTIVITE DU CANAL SUR2/KIR6.1 ... 135

12.2 ANALYSE DE L’ACTIVITE DU CANAL NAV1.5 ... 137

DISCUSSION ... 138

CONCLUSION GENERALE... 149

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 150

PUBLICATIONS ... 191

(11)

Table des illustrations

Liste des figures

Figure H1 : Représentation du pourcentage des différentes populations cellulaires du cœur humain ____ 2 Figure H2 : Hétérogénéité de l’excitabilité cellulaire au sein de l’organe cœur _____________________ 3 Figure H3 : Le couplage excitation-contraction. _____________________________________________ 4 Figure H4 : L’origine des fibroblastes cardiaques ___________________________________________ 10 Figure H5 : Interaction du fibroblaste cardiaque avec la MEC et un cardiomyocyte. ________________ 14 Figure H6 : Les différents rôles du fibroblaste cardiaque _____________________________________ 16 Figure H7 : Le rôle central des fibroblastes cardiaques en réponse à des signaux pro-inflammatoires et profibrotiques _______________________________________________________________________ 27 Figure H8 : Modèles de co-culture cellulaire in vitro ________________________________________ 30 Figure H9 : Modèles de culture cellulaire cardiaque in vitro __________________________________ 31 Figure H10 : Les effets du couplage fibroblaste-cardiomyocyte sur le potentiel d’action _____________ 33 Figure H11 : Activation épicardique et interactions des différentes composantes cellulaires cardiaques au cours de la fibrose ____________________________________________________________________ 34 Figure H12 : Les effets cellulaires de la TGF-β dans la fibrose cardiaque ________________________ 37 Figure H13 : Schématisation de la voie de signalisation TGF-β/SMAD dans la fibrose cardiaque _____ 38 Figure H14 : Structure des différents peptides natriurétiques __________________________________ 43 Figure H15 : Alignement de séquences des peptides natriurétiques via la base de données NCBI ______ 45 Figure H16 : A. La séquence peptidique de l’ANP vs la séquence peptidique du fsANP ______________ 48 Figure H17 : Proposition topologique de la structure de base commune des GCs et leurs activateurs___ 53 Figure H18 : Topologie et ligands des récepteurs GC des peptides natriurétiques __________________ 56 Figure H19 : NPRC internalise les trois peptides natriurétiques pour être dégradé par les protéases intracellulaire. _______________________________________________________________________ 59 Figure H20 : Schéma simplifié des voies guanylate cyclase ____________________________________ 61 Figure H21 : Les différentes structures et domaines d’organisation des phosphodiestérases __________ 67 Figure H22 : Régulation du rétrocontrôle négatif de la signalisation GMPc via PDE2 et PDE5 dans le cardiomyocyte _______________________________________________________________________ 69 Figure H23 : Structure des nucléotides cycliques et site d’action des PDEs _______________________ 71

Figure MM1: Protocole de dissociation de fibroblastes cardiaques de rat par dissociation enzymatique 77 Figure MM2: L’oxidation du tetrazolium __________________________________________________ 79 Figure MM3: Les différents types d’ELISA _________________________________________________ 83 Figure MM4: Analyse de la migration des cellules 3T3 de souris par un scratch test ________________ 85 Figure MM5: Les différentes phases de l’extraction de l’ARN __________________________________ 89 Figure MM6: Le principe de la qRT-PCR utilisant le Sybr Green _______________________________ 90 Figure MM7: Etape de l’électrotransfert du Western Blot _____________________________________ 95 Figure MM8: Les configurations d’enregistrements utilisées __________________________________ 100

Figure R1: Marquage des myofibroblastes cardiaques de rats adultes __________________________ 104 Figure R2: Les effets de l'ANP sur la prolifération cellulaire dans les fibroblastes ventriculaires de rat 106 Figure R3: Les effets de l'ANP sur la sécrétion de collagène dans les fibroblastes ventriculaires de rat _ 107

(12)

Figure R4 : La sécrétion d’IL-6 par les fibroblastes ventriculaires au cours de la differenciation _______ 108 Figure R5: Effet de l’ANP sur la migration des fibroblastes ventriculaires de rat à 10 jours de culture _ 109 Figure R6 : Effet de l’ANP en présence de l’angiotensine II sur la prolifération des fibroblastes cardiaques de rats adultes _______________________________________________________________________________________________ 110 Figure R7: Effet de l’ANP en présence de l’angiotensine II sur la sécrétion de collagène par les fibroblastes cardiaques de rats adultes _____________________________________________________________________ 111 Figure R8: Expression génomique des récepteurs de peptides natriurétiques de type A et de type B dans les myofibroblastes cardiaques après 12 jours de culture ______________________________________________________ 113 Figure R9: Expression protéique des récepteurs de peptides natriurétiques de type A et de type B dans les myofibroblastes cardiaques après 12 jours de culture ______________________________________________________ 114 Figure R10: Immunomarquage des récepteurs de peptides natriurétiques de type A et de type B dans les myofibroblastes cardiaques après 10 jours de culture ______________________________________________________ 115 Figure R11: Effet du siRNA sur l'expression des récepteurs des peptides natriurétiques A et B dans les myofibroblastes ventriculaires de rats adultes à 12 jours de culture _______________________________________ 117 Figure R12: Effet des siNPRA et siNPRB sur les propriétés de prolifération cellulaire et de sécrétion de collagène des myofibroblastes cardiaques __________________________________________________________________ 118 Figure R13: Effets du 8-Br-GMPc sur la prolifération cellulaire des fibroblastes cardiaques de rat _____ 120 Figure R14: Effets du 8-Br-GMPc sur la sécrétion de collagène durant la différenciation des fibroblastes cardiaques de rat ____________________________________________________________________________________________ 121 Figure R15: Profil d’expression génomique des isoformes des phosphodiestérases dans les myofibroblastes ventriculaires ________________________________________________________________________________________________ 122 Figure R16: Effet de l'inhibition des PDEs sur la prolifération cellulaire des fibroblastes cardiaques. Toutes les expériences ont été effectuées après 12 jours de culture ________________________________________ 124 Figure R17: Effet de l'inhibition des PDEs sur la sécrétion de collagène par les myofibroblastes ventriculaires à 12 jours de culture _________________________________________________________________________ 125 Figure R18: Dosage du GMP cyclique intracellulaire dans les cultures de myofibroblastes cardiaques à 12 jours de culture ______________________________________________________________________________________________ 127 Figure R19 : Diminution de propriétés fibroblastiques rapporté à des concentrations ascendantes de GMPc intracellulaire ________________________________________________________________________________________________ 128 Figure R20: Dosage de l’AMP cyclique intracellulaire dans les cultures de myofibroblastes ventriculaires à 12 jours de culture _________________________________________________________________________________________ 129 Figure R21: Expression génomique du gène acta2 dans les myofibroblastes cardiaques après 12 jours de culture ________________________________________________________________________________________________________ 131 Figure R22: Expression génomique des gènes gata4 et tbx5 dans les myofibroblastes ventriculaires à 12 jours de culture ______________________________________________________________________________________________ 132 Figure R23: Représentations graphiques de l’activation d’un efflux d’iodure sur des fibroblastes ventriculaires de rats adultes en présence de l’activateur A23187 _________________________________________ 133 Figure R24: Représentations graphiques des valeurs moyennées des pics d’efflux d’iodure sur des myofibroblastes ventriculaires de rats adultes à 10 jours de culture _______________________________________ 134 Figure R25: Courbe I/V obtenue en condition contrôle à 12 jours de culture _____________________________ 136 Figure R26: Effets du pinacidil sur l’amplitude de courants enregistrés à un potentiel de 50 mV ________ 136 Figure R27: Enregistrements de courants enregistrés en configuration cellule entière lors de dépolarisations membranaires ______________________________________________________________________________ 137

Figure D1: Schéma récapitulatif montrant les effets de l’ANP sur les propriétés fonctionnelles des fibroblastes ventriculaires de rat Wistar adulte _____________________________________________________________ 147

(13)

Liste des tableaux

Tableau H1 : Les marqueurs des fibroblastes ... 13 Tableau H2 : Principaux canaux ioniques rapportés dans la littérature comme participant à l’électrophysiologie du fibroblaste cardiaque ... 19 Tableau H3 : Localisation chromosomique des gènes, le taux plasmatique et le temps de demi-vie des peptides natriurétiques humains. ... 44 Tableau H4 : Nomenclature, distributions tissulaires, ligands et principales fonctions des récepteurs guanylyl cyclase ... 54 Tableau H5 : Les substrats des cGMP-dependent protein kinases (cGKs) et leurs fonctions physiologiques chez l’homme ... 63 Tableau H6 : Les différents types de phosphodiestérases ... 66

Tableau MM1: Les solutions utilisées pour la dissociation de fibroblastes cardiaques de rat _____________ 78 Tableau MM2: Les anticorps utilisés pour l’immunomarquage____________________________________________ 87 Tableau MM3: Les amorces utilisées pour la PCR quantitative ____________________________________________ 92 Tableau MM4: Composition du milieu d’efflux ______________________________________________________________ 97 Tableau MM5: Composition du milieu extracellulaire ____________________________________________________ 101 Tableau MM6: Composition du milieu intrapipette _______________________________________________________ 101

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Liste des abréviations

1-10

3T3-L1 3-day transfer, inoculum 3 x 105 cells - Line 1

4-AP 4-aminopyridine

8-Br-cGMP 8-Bromo-cyclic guanosine monophosphate

A

ACE Angiotensin conversion enzyme

ADAMTS A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs

AM Adrenomedullin

AM1r/AM2r Adrenomedullin 1/2 receptor

AMDM Acromesomelic dysplasia Maroteaux type

cAMP Cyclic adenosine monophosphate

Ang II Angiotensine II

ANO1 Anoctamine 1

ANP Atrial natriuretic peptide

APS Ammonium persulfate

ATB Antiobiotique

AT1R Angiotensin II receptor type 1

ATP Adenosine Tri Phosphate

B

Ba2+ Barium ion

BAMBI Bone morphogenetic protein (BMP) and activin membrane-bound inhibitor

BDM 2,3-butanedione 2-monoxime

BKCa (Big) calcium activated potassium channel

BNP Brain or B-type natriuretic peptide

BSA Bovine serum albumin

C

Ca2+ Calcium ion

CaCC Calcium-activated chloride channel

CaM Calmodulin

CAMKII Calcium Calmodulin kinase II

CAMKIV Calcium Calmodulin kinase VI

CCN Nomenclature dérivée d’après les trois premières lettres de : CYR61, CTGF et NOV

CE Cellule endothéliale

cGK cGMP dependent protein kinase

Clcn3 Chloride channel voltage-sensitive 3

CML Cellule musculaire lisse

CMR Cardiovascular magnetic resonance

CNP C-type natriuretic peptide

CO Monoxyde de carbone

CREB cAMP response element-binding protein

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CTGF Connective tissue growth factor

Cx Connexin

CYP11B2 Cytochrome P450, family 11, subfamily B, polypeptide 2

D

DAB Diaminobenzidine tetrahydrochloride

DDR2 Discoidin domain receptor 2

DEPC Diethylpyrocarbonate

DIDS 4,49-Diisothiocyanatostilbene-2,29-disulfonic acid

DNP Dendroaspis natriuretic peptide

DPP4 Dipeptidyl peptidase IV

DTT Dithiothreitol

E

ECL Enhanced Chemiluminescence

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EGTA Ethylene glycol tetraacetic acid

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

EMT Epithelial-mesenchymal transition

EndMT Endothelial-mesenchymal transition

ERK1/2 Extracellular signal-related kinase 1/2

ET-1 Endothelin 1

F

FAP Fibroblast activation protein

FGF Fibroblast growth factor

fsANP Frame shift ANP

G

GAF cGMP-specific phosphodiesterases, adenylyl cyclases and FhlA

pGC Particulate guanylyl cyclase

sGC Soluble guanylyl cyclase

GCAP 1/2 Guanylyl cyclase activating protein 1/2

cGMPc Cyclic guanosine monophosphate

gp130 Glycoprotein 130

H

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

Hv1 Voltage-gated hydrogen channel 1

I

IBMX 3-Isobutyl-1- methylxanthine

ICER Inducible cAMP early repressor

ICl.vol Volume activated chloride current

IK(Ca) Calcium activated potassium current

IK1 Inward rectifying potassium current

IKATP ATP dependent potassium current

IKf Fast delayed rectifier current

IKs Slow inward rectifier current

(16)

IL(x)R Interleukin receptor (x représente 1 ou 6)

IP3 Inositol triphosphate

iPDE Inhibiteur de la phosphodiestérase

Ito Transient outward potassium current

K

K+ Potassium ion

KCa1.1 Calcium activated potassium channel 1.1

KHD Protein kinase homology domain

Kir Inward rectifier potassium channel

KO Knock-out

Kv Voltage-gated potassium channel

M

MAP Mitogen-activated protein

ME Microscopie électronique

MEC Matrice extracellulaire

MEF2 Myocyte enhancer factor 2

MHC Myosin heavy chain

MMP Matrix metalloproteinase

MSC Mesenchymal stem cell

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

N

Na+ Sodium ion

Nav Voltage-gated sodium channel

NCX Sodium calcium exchanger

NEP Neprilysin ou Neutral endopeptidase

NF-κB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NFAT Nuclear factor of activated T-cells

NHE Sodium proton exchanger

NO Monoxyde d’azote

NP Natriuretic peptide

NPPA Natriuretic peptide precursor A

NPPB Natriuretic peptide precursor B

NPPC Natriuretic peptide precursor C

NPR-A Natriuretic peptide receptor A

NPR-B Natriuretic peptide receptor B

NPR-C Natriuretic peptide receptor C

NSCC Non selective cation channel

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

O

OPN Osteopontin

ORCC Outwardly rectifying chloride channel

P

PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

(17)

PAS Nomenclature dérivée d’après les trois premières lettres de Per, Arnt et Sim

PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

PDE Phosphodiesterase

PDGF Platelet-derived growth factor

PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase

PKA cAMP-dependent protein kinase

PKB Protein kinase B

PKC Protein kinase C

PKG cGMP-dependent protein kinase

PLN Phospholamban

R

ROS Reactive oxygen species

RyR2 Ryanodine receptor 2

S

S1P Sphingosine 1 phosphate

SDS Sodium dodecyl dulfate

SERCA Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase

SMAD Small mothers against decapentaplegic

α-SMA α- Smooth muscle actin

SOC Store operated channels

SPARC Secreted protein acidic and rich in cysteine

SPP1 Secreted phosphoprotein 1

SRE Serum response element

SUR2 Sulfonylurea receptor 2

SVF Sérum de veau fœtal

T

TAK-1 TGF- activated kinase

TBS Tris-buffered saline

TEA Tetraethylammonium

TEMED Tetramethylethylenediamine

TGF- Transforming growth factor

TGF- RI/II Transforming growth factor receptor I/II TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinase TNF-RI/II Tumor necrosis factor receptor I/II

TNF-α Tumor necrosis factor α

TRP Transient receptor potential channel

TSP Thrombospondin

TTX Tetrodotoxin

U

UCR Upstream conserved region

V

VEGF-D Vascular endothelial growth factor D

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SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Le cœur : de la morphologie à la fonction

« Le cœur est le début de la vie, car c'est par le cœur, que le sang est avancé... La source de toute action…» écrivait William Harvey en 167γ. Le cœur est le premier organe fonctionnel chez l’embryon. Dès l’accumulation des premières protéines contractiles et l’organisation des premiers myofilaments, l’activité électrique et les premiers battements cardiaques deviennent détectables (Hirota et al. 1987).

La dissection structurelle et fonctionnelle du cœur des mammifères a révélé plusieurs éléments-clés impliqués dans son automatisme et sa fonction de pompe. En partant de l’identification des différentes régions et chambres cardiaques, arrivant aux différentes composantes cellulaires et en terminant par les interactions intercellulaires, les mécanismes physiologiques et pathologiques du cœur restent très étudiés à travers le temps.

1.1 Cellules myocytaires et non myocytaires

Le cœur se compose d'environ 60-70% de cellules « non myocytaires », principalement les fibroblastes, et de 25-30% de cardiomocytes (Zak, 1974; Nag, 1980; Camelliti et al., 2005; Baudino et al., 2006). La fonction cardiaque normale est régulée par des interactions coordonnées et dynamiques de ces deux types cellulaires, qui représentent ensemble plus de 90% des cellules dans le myocarde (Porter & Turner, 2009) (Figure H1). Les fibroblastes cardiaques sont une source importante de composants de la matrice extracellulaire régulant les signaux électriques, mécaniques et chimiques entre les composants cellulaires et acellulaires. Les cardiomyocytes sont moins nombreux, mais occupent un volume très important du myocarde (75%). Ces cellules fusiformes et striées, sont les constituants contractiles qui fournissent la force mécanique. D’autres cellules ont été identifiées dans le cœur et présentent près de 5% du volume cellulaire total, ce sont les cellules musculaires lisses vasculaires et les cellules endothéliales (Banerjee et al., 2007) (Figure H1).

(19)

Plusieurs études utilisant des marqueurs cellulaires spécifiques ont montré que le myocarde présente des différences régionales distinctes, influencées par la nature physiologique de chaque région, comme le myocarde auriculaire ou ventriculaire, le nœud sinusal, le nœud auriculo-ventriculaire, le réseau de Purkinje ou le faisceau de His.

Figure H1 : Représentation du pourcentage des différentes populations cellulaires du cœur humain.

CML : cellules musculaires lisses; CE : cellules endothéliales. Les données d’après Souders et al., 2009; Porter & Turner 2009.

1.2 Automatisme et conduction

L’autorythmicité est l’une des caractéristiques principales du cœur. L’automatisme cardiaque et la coordination de la contraction du cœur entre les quatre cavités sont dus aux cellules nodales et aux tissus conducteurs. Ces cellules produisent spontanément un signal électrique, qui est à l’origine du potentiel d’action (Figure Hβ). La propagation cellulaire du signal va entraîner la contraction du cœur : ceci est traduit par la dépolarisation et la contraction des cardiomyocytes.

Le tissu nodal est formé du nœud sinusal dit de Keith et Flack et du nœud auriculo-ventriculaire dit d’Aschoff-Tawara. A partir du nœud auriculo-auriculo-ventriculaire, un réseau cellulaire assure la conduction rapide de la dépolarisation à l’ensemble du myocarde ventriculaire, par le faisceau de His : tronc, branches droite et gauche puis les fibres de

(20)

Purkinje. Le septum interventriculaire est dépolarisé de la gauche vers la droite puis les ventricules de l’endocarde vers le myocarde.

Figure H2 : Hétérogénéité de l’excitabilité cellulaire au sein de l’organe cœur : Potentiels d’action

typiques enregistrés du nœud sinusal jusqu’au myocyte ventriculaire. Modifiée d’après http://www.bem.fi/book/06/06.htm.

1.3 Couplage excitation-contraction

L'excitation électrique du myocyte initie une augmentation transitoire de la concentration du calcium intracellulaire. Les événements couplant la dépolarisation du sarcolemme à l'élévation du calcium et le début de la contraction sont connus sous le nom de couplage excitation-contraction.

Lors de la dépolarisation membranaire, un influx calcique se produit notamment via les canaux calciques de type L (Bers, 2002). Cette entrée ionique va alors permettre la libération du calcium intracellulaire en activant des récepteurs à la ryanodine présents à la surface du réticulum sarcoplasmique par le mécanisme «calcium-induced calcium release » (Fabiato 1983; Maier & Bers, 2002). Les ions Ca2+ vont alors se lier à la troponine C et générer un changement de conformation du complexe troponine-tropomyosine. L’énergie nécessaire à ce processus provient de l’hydrolyse de l’ATP par l’ATPase de la myosine : les sites actifs d’actine libérés, vont activer l’ATPase des têtes de myosine et permettre le glissement des

(21)

myofilaments de myosine par rapport au myofilaments d’actine. La transmission du potentiel d’action le long du sarcolemme de chaque cellule va provoquer un raccourcissement du sarcomère à l'origine de la contraction (Figure H3).

Figure H3 : Le couplage excitation-contraction est initié par le potentiel d'action qui excite le

sarcolemme le long de ses tubules T. Cette dépolarisation provoque l’ouverture rapide des canaux Na+

voltage-dépendants, qui dépolarise davantage la membrane cellulaire et permet l’entrée calcique via les canaux Ca2+ voltage-dépendants. Le courant calcique déclenche alors l'ouverture du récepteur à la ryanodine 2 (RyR2) par le processus « calcium-induced calcium-release », induisant la libération du calcium du réticulum sarcoplasmique. Le Ca2+ libéré à partir réticulum se fixe sur la troponine C du complexe troponine-tropomyosine sur les filaments d'actine dans les sarcomères, ce qui facilite la formation de ponts entre l'actine et la myosine et ainsi la contraction myocardique. Les canaux K+ voltage-dépendants s’ouvrent pour favoriser la repolarisation du potentiel d’action afin d’établir des conditions nécessaires pour la relaxation. La relaxation se produit lorsque le Ca2+ est repompé vers le réticulum sarcoplasmique par l'action de la Ca2+ ATPase (SERCA2a) et est extrudé de la cellule via l’échangeur NCX. La SERCAβa est limitée par phospholamban (PLN) dans des conditions de repos. D’après Luo & Anderson, 2013.

Toutes les cellules myocardiques contractiles dépolarisées se contractent de manière synchrone. Après chaque activation, les cellules cardiaques passent par une phase inexcitable appelée période réfractaire. Cette période est d’abord absolue, lorsqu’aucune nouvelle dépolarisation ne peut être induite quelle que soit la durée et l’intensité de la stimulation. Elle est ensuite relative, lorsque la dépolarisation peut être déclenchée mais par un stimulus plus intense ou plus long que durant la diastole.

(22)

1.4 Couplage excitation-transcription

Le calcium régule non seulement la contraction mais également le phénotype de la cellule

via l’activation de kinases et de phosphatases qui modulent l’activité des facteurs de

transcription. Ce processus se produit sur une période de temps beaucoup plus longue que le couplage excitation-contraction. Les phénomènes sous-jacents sont particulièrement bien décrits dans le remodelage hypertrophique du cœur et le remodelage vasculaire associé à la prolifération des cellules musculaire lisses.

Des travaux ont montré que l’amplitude et la durée des signaux calciques, ainsi que le mode d’entrée du calcium dans les cellules, déterminent le type de facteur de transcription activé (Bading et al., 1993; Dolmetsch et al., 1997; Hardingham et al., 1997; Dolmetsch et al., 2001). La localisation du signal calcique est également importante. Ainsi, les facteurs de transcription SRE (serum response element) ou NFAT (Nuclear factor of activated T-cells) répondent à une élévation du calcium cytosolique alors que CREB (cAMP response element-binding protein) est sensible à une augmentation du calcium au niveau du noyau (Hardingham

et al., 1997). Les études de Dolmetsch et collaborateurs en 2001 ont montré que l’influx

calcique par les canaux calciques voltage-dépendants de type L était particulièrement important pour l’activation des facteurs CREB et MEFβ (myocyte enhancer factor-2). Plusieurs mécanismes peuvent relier les canaux L à l’activation des facteurs de transcription. Tout d’abord le calcium entrant par les canaux L peut diffuser jusqu’au noyau et activer des enzymes nucléaires comme la Calcium/Calmoduline Kinase IV (CAMKIV) qui régule l’activité des facteurs de transcription et leurs co-régulateurs. De plus, l’influx de calcium peut activer des protéines près de la sortie du canal, qui propagent le signal jusqu’au noyau avec d’autres régulateurs pour activer l’expression de gènes (Gomez-Ospina et al., 2006).

Dans le cardiomyocyte, le récepteur à l’IP3 (Inositol trisphosphate) est localisé sur le

réticulum sarcoplasmique au niveau de la membrane nucléaire, où il s’associe avec la CAMKII (Calcium/Calmoduline Kinase II). Il est à noter que la membrane nucléaire et le réticulum sont fortement interconnectés dans le cardiomyocyte (Wu & Bers, 2006; Wu et al., 2006) et que le calcium peut diffuser librement d’un compartiment à l’autre. La stimulation du myocyte par l’endothéline-1 induit l’activation de la phospholipase C, la production d’IP3 et une élévation

(23)

Enfin, le réticulum sarco/endoplasmique joue un rôle important dans l’activation des facteurs de transcription. La libération du calcium par le récepteur à l’IP3 induit une déplétion

calcique du réticulum et donc l’activation d’un influx par les canaux de type SOC (Store-operated channels). Cela se traduit par une augmentation soutenue du calcium cytosolique nécessaire à l’activation de la calcineurine et du facteur de transcription NFAT.

1.5 Fonction endocrine

Le cœur possède, en plus de sa fonction de pompe, une fonction endocrine. Les cellules cardiaques secrètent principalement les peptides natriurétiques, mais également d'autres hormones telles que l’adrénomédulline (AM), l’endothéline 1 (ET-1), la cardiotrophine-1 et l’aldostérone. Les niveaux d’expression de ces hormones dans le cœur augmentent dans diverses pathologies cardiovasculaires. Ces hormones synthétisées localement peuvent être considérées comme agissant localement sur le cœur d'une manière paracrine et/ou autocrine. L’implication et l’expression des peptides natriurétiques et leurs récepteurs dans le cœur seront discutés ultérieurement.

- L’adrénomédulline cardiaque

L’AM est un polypeptide de 5β acides aminés, contenant un anneau à six résidus, liés par un pont disulfure (Eto et al., 2003), secrété principalement par les cellules endothéliales vasculaires. Les principaux récepteurs de cette hormone sont l’AM1r (AM1 receptor) et l’AMβr (AMβ receptor). L’AM présente des effets hypotenseur, diurétique et natriurétique (Rademaker et al., 2003), mais son rôle dans le développement des pathologies cardiaques reste peu élucidé. Sa concentration plasmatique est augmentée chez les patients atteints d’hypertension artérielle systémique, d’insuffisance cardiaque congestive, ou d'insuffisance rénale (Kangawa et al., 1996).

L’augmentation de l’adrénomedulline dans l'insuffisance cardiaque est due au cœur en lui-même (Jougasaki et al., 1995), car les taux plasmatiques de l’AM sont en relation avec la gravité de l’insuffisance. Étant donné que les cardiomyocytes possèdent des récepteurs AM (Owji et al., 1995) et que l’AM inhibe la synthèse protéique dans des cultures de myocytes (Tsuruda et al., 1998), il a été suggéré que l’AM pouvait agir comme un agent anti-hypertrophique. Les cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IL-1 peuvent stimuler la sécrétion de l’AM par les fibroblastes cardiaques (Horio et al., 1998; Tomoda et

(24)

- L’endothéline 1

Ce polypeptide de 21 acides aminés a été d'abord isolé à partir du milieu de culture de cellules endothéliales avant d'être séquencé en 1988 (Yanagisawa et al., 1988b). Trois isoformes ont été mises en évidence (ET-1, 2 et 3) (Yanagisawa & Masaki, 1989a, b) : ET1 est l'isoforme prédominante (Masaki, 1989) et son niveau plasmatique est de l’ordre de β à 6 pmol/l. Une concentration élevée de l’ET-1 est trouvée dans les vaisseaux sanguins (Wei

et al., 1993). Cependant, ET1 est trouvée aussi dans les cardiomyocytes, les cellules

musculaires lisses vasculaires et les reins (Sakurai et al., 1991; Wong et al., 1998). Quatre récepteurs à l’endothéline, couplés à une protéine G, ont été identifiés : ETA, ETB1, ETB2 et

ETC.

L’endothéline 1 produit une puissante vasoconstriction de longue durée, qui entraîne une augmentation de la pression artérielle (Yanagisawa et al., 1988a; Yanagisawa et al., 1988b). Elle présente aussi des effets inotropes et chronotropes positifs sur le muscle cardiaque (Ishikawa et al., 1988). Dans les fibroblastes cardiaques, l’endothtéline 1 favorise la synthèse du collagène. Des études ont montrées également que ET-1 pourra stimuler la sécrétion et la synthèse des peptides natriurétiques par les myocytes (Horio et

al., 1993; Bruneau et al., 1997). Les taux plasmatiques de l’ET-1 sont augmentés dans

l'insuffisance cardiaque congestive, l'infarctus du myocarde, l'hypertension pulmonaire et l'insuffisance rénale. Plusieurs résultats suggèrent que ce polypeptide, produit localement dans le cœur, peut avoir des effets hypertrophiques et fibrotiques, contribuant ainsi au remodelage cardiaque (McMurray et al., 1992; Giaid et al., 1993).

- La cardiotrophine-1

La comparaison de sa séquence d'acides aminés et de sa structure conformationnelle indique que la cardiotrophine-1 (CT-1) appartient à la famille de l'interleukine 6 (IL-6). En effet, elle partage avec l’IL-6 son récepteur (IL6R), ayant aussi la gp130 comme protéine de signalisation transmembranaire (Jougasaki, 2010). Elle est sécrétée par le cœur et est impliquée dans l’hypertrophie et la cardioprotection (Asai et al., 2000). Les taux plasmatiques de la CT-1 sont en corrélation avec l’augmentation de la pression artérielle systolique (Pemberton et al., 2005) et l’hypertrophie ventriculaire gauche (López et al., 2005) chez les patients hypertendus. Les concentrations plasmatiques de la CT-1 sont également élevées chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque (Talwar et al., 2000) et en post-infarctus aigu du myocarde (Talwar et al., 2002).

(25)

Finalement, l'augmentation de la CT-1 est en corrélation avec la sévérité du dysfonctionnement ventriculaire gauche.

- L’aldostérone

L’hypothèse selon laquelle le cœur serait capable de produire de l’aldostérone remonte à plusieurs décennies. Des expérimentions réalisées sur cœur perfusé ont montré des effets de minéralocorticoïdes (Knox & Lockett, 1969). Plus récemment, le rôle du cœur en tant que source importante de production d'aldostérone a été remis en question (Funder, 2004; Gomez-Sanchez et al., 2004). La production d’aldostérone dite « extra-surrénalienne » se fait principalement par les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses vasculaires (Weber, 2001). Cette hormone se fixe principalement sur son récepteur minéralocorticoïde. Les études ont montré que CYP11B2, l'enzyme qui catalyse l'étape terminale de la synthèse de l'aldostérone, est surexprimée en insuffisance cardiaque congestive (Yoshimura et al., 2002).

Ces hormones polypeptidiques semblent contribuer dans la régulation hémodynamique cardiovasculaire par leurs effets sur le tonus vasculaire, l'activité du système nerveux autonome et sur la masse cardiaque tant dans les conditions physiologiques que physiopathologiques.

2. Les fibroblastes et myofibroblastes cardiaques

2.1 Propriétés phénotypiques

Comme indiqué précédemment, les principaux constituants cellulaires du cœur sont les fibroblastes, les myocytes, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses vasculaires; la majorité étant composée de fibroblastes et de myocytes (Camelliti et al., 2005; Baudino et al., 2006). Ces cellules contribuent ensemble à maintenir les propriétés électriques, biochimiques et mécaniques du cœur. De plus, elles permettent de préserver sa structure tridimensionnelle via un schéma complexe d’interactions auto- et paracrines (Manabe et al., 2002). L’altération de cette homéostasie aboutit à un remodelage du cœur de type compensatoire ou délétère.

(26)

Les fibroblastes ont souvent été considérés comme un type cellulaire uniforme ayant des fonctions comparables indépendamment de l’organe de provenance (cœur, peau ou autres tissus). Cependant, plusieurs études ont pu démontrer ultérieurement qu’il existe une vaste hétérogénéité phénotypique entre les fibroblastes provenant de différents tissus, voire au sein d'un même tissu et selon différentes conditions physiologiques (Chang et al., 2002).

Cette « plasticité » phénotypique constitue un défi unique pour les chercheurs afin de mieux définir et caractériser les fibroblastes cardiaques.

2.1.1 Origine

Les fibroblastes sont les cellules constitutives du tissu conjonctif présent chez tous les vertébrés. Une hétérogénéité à la fois morphologique et fonctionnelle est observée au cours du développement de ces cellules.

Au cours du développement embryonnaire, le fibroblaste cardiaque prend origine des cellules épithéliales du proepicardium via un processus dit transformation épithélio-mésenchymateuse (EMT) (Figure H4).

Dans les valves, les fibroblastes proviennent de la transition endo-mesenchymale (EndMT) de l’endocarde. De plus, le fibroblaste peut également provenir de cellules périvasculaires, monocytes circulants, de cellules progénitrices de la moelle osseuse ou encore de fibrocytes circulants (Moorman & Christoffels, 2003; Visconti et al., 2006; Norris et al., 2008).

Plusieurs études, menées sur des animaux adultes, suggèrent une progression des méso-angioblastes vers des péricytes, qui se sont avérés posséder un potentiel de différenciation en myofibroblastes (Lin et al., 2008). Ainsi les péricytes et les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) de la moelle osseuse peuvent contribuer à la population des fibroblastes (Sartore et al., 2001) (Figure H4).

(27)

Figure H4 : L’origine des fibroblastes cardiaques. Les fibroblastes cardiaques sont dérivés

principalement des cellules épithéliales du proepicardium par la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et des cellules endothéliales par la transition endo-mesenchymale (EndMT). Ils peuvent aussi être dérivés de cellules périvasculaires, des monocytes circulants et des cellules progénitrices de la moelle osseuse et de fibrocytes circulants. D’après Krenning et al., 2010.

Dans le cœur adulte, le renouvellement des fibroblastes est faible. Dans les conditions physiologiques normales, il se fait à partir de fibroblastes endogènes ou ceux issus de la EMT. Cependant, dans des conditions physiopathologiques, telles que l’hypertrophie cardiaque ou l’infarctus du myocarde, les fibroblastes peuvent provenir des fibrocytes (cellules dérivées de la moelle osseuse) (Strieter et al., 2007; Wu et al., 2007).

Les fibrocytes sont généralement définis par leur capacité de croissance et par leur phénotype membranaire. Ces cellules présentent de nombreuses similitudes avec les fibroblastes comme l'expression constitutive de collagène, bien qu'elles expriment également les marqueurs membranaires des leucocytes et des cellules progénitrices hématopoïétiques (Chesney et al., 1998; Abe et al., 2001). Les fibrocytes ont la possibilité de placer la matrice extracellulaire (MEC) dans la fibrose et la cicatrisation, ainsi que dans la réponse immunitaire.

the epithelial cells of the proepicardium through a process termed epithelial–mesenchymal transition (EMT). Valvular fibroblast arise through endothelial–mesenchymal transition

(28)

2.1.2 Morphologie

Les fibroblastes sont des cellules plates, étalées dans des plans interfasciculaires. Ces cellules présentent un corps cellulaire fusiforme ou étoilé avec de longs prolongements cytoplasmiques, en plus d’un noyau ovoïde et allongé.

L’absence d’une membrane basale le séparant des autres types cellulaires cardiaques, lui confère un caractère morphologique particulier. Ainsi ils ont tendance à exposer leur réticulum endoplasmique rugueux et un appareil de Golgi proéminent.

In vivo, les fibroblastes cardiaques forment de grandes extensions en forme de feuillet, avec

des plis irréguliers et des digitations (De Mazière et al., 1992). La reconstruction d'un fibroblaste du nœud sino-auriculaire de lapin, par microscopie électronique (ME), montre une cellule formant une juxtaposition de membrane avec le cardiomyocyte voisin couvrant 720 μm2

(De Mazière et al., 1992), la surface totale de cette cellule ayant 1500 μm2 avec les extensions les plus éloignées. En revanche in vitro, les fibroblastes fraîchement isolés sont des cellules arrondies ayant un diamètre d'environ 7-9 μm (Dawson et al., 2012). Les données de la ME ont montré que ces cellules sont dépourvues de membrane basale et présentent des plis ou des invaginations, caractéristiques du fibroblaste in vivo (Rook et al., 1988).

Compte tenu de leur forme quasi-sphérique, la surface membranaire calculée des fibroblastes fraîchement isolés est de 150 à β50 μm2

.

Les fibroblastes sont considérés comme étant des cellules non vasculaires, non épithéliales et non inflammatoires. Dans tous les tissus, les fibroblastes sont généralement adhérents aux fibres qu'ils synthétisent et peuvent ainsi former un réseau 3D et s'incruster dans la matrice fibrillaire (Drake et al., 2003).

(29)

2.1.3 Marqueurs des fibroblastes

Un grand nombre de marqueurs de fibroblastes a été identifié. Ces marqueurs sont exprimés dans les fibroblastes mais aussi au niveau d’autres types cellulaires (Tableau H1).

- Camellitti et al. 2005 ont montré que le récepteur 2 du domaine de la Discoïdin 2 (DDR2) est exprimé par les fibroblastes cardiaques. Il régule leur croissance, leur migration et leur différenciation.

- La fibronectine possède un rôle important dans l’organisation de la MEC en contrôlant la disposition et l’orientation du collagène, et contribue à la fixation et à l’adhérence du cytosquelette des cellules à la MEC (MacKenna et al., 2000; Manso et al., 2009).

- La vimentine, une protéine de filament intermédiaire du cytosquelette, est aussi fortement exprimée dans les fibroblastes (Lane et al., 1983; Duprey & Paulin, 1995). Ce marqueur est utilisé dans nos travaux pour le marquage des fibroblastes cardiaques.

- Chang et al. ont également montré en 2002 que la FAP (Fibroblast Activation Protein) est fortement exprimée dans les fibroblastes.

- Un autre marqueur d'intérêt est la la cadhérine-11 (Valencia et al., 2004). Cette dernière semble avoir un rôle important dans le remodelage vasculaire après une lésion cardiaque, comme dans l’infarctus, via l’augmentation de la sécrétion du VEGF-D (Vascular endothelial growth factor D) par les fibroblastes (Orlandini & Oliviero, 2001).

(30)

Tableau H1 : Les marqueurs des fibroblastes. Modifié d’après Krenning et al., 2010.

Protein

Function

Other cell type expression

Fibronectin Cell adhesion molecule Smooth muscle cells, chondrocytes, macrophages

Cadherin-9 Ca

2+

-dependent adhesion

molecule Neurons, tumor vasculature CD40 TNFα receptor family

member Various antigen presenting cells CD248 (TEM1) Collagen receptor Pericytes, endothelial cells

Col1a1 Collagen type I

biosynthesis Osteoblasts, chondroblasts Discoidin domain receptor

2 (DDR2)

Collagen-binding tyrosine kinase receptor

Smooth muscle cells, hepatic stellate cells, endothelial cells

Fibroblast activation protein-1 (FAP1)

Serine protease

(gelatinase) Activated melanocytes Fibroblast-specific

protein-1 (FSP1/S100A4)

Intermediate-filament associated Ca2+- binding

protein

Smooth muscle cells, invasive carcinoma cells

Fibroblast surface antigen (FSA)

Fibronectin-binding

molecule Monocytes/macrophages

Heat shock protein-47 (HSP47)

Collagen-binding serpin chaperone

Monocytes/macrophages, various collagen-producing cells

Platelet-derived growth factor

receptor-(PDGFRb)

Receptor tyrosine kinase Smooth muscle cells, pericytes

Prolyl-4-hydroxylase Collagen biosynthesis Endothelial cells, epithelial cells Thymus cell antigen-1

(THY1/CD90) Cell adhesion molecule

Leukocytes, endothelial cells, various progenitor cells

Vimentin Intermediate-filament associated protein

Endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, myoepithelial cells

(31)

2.1.4 Ultrastructure

Les caractéristiques ultrastructurales typiques des fibroblastes consistent en un cytoplasme contenant des vésicules, des vacuoles et des mitochondries avec relativement peu de microfilaments ou de filaments intermédiaires; un réticulum endoplasmique rugueux dilaté; un appareil de Golgi proéminent dans la région périnuclaire et des composants granulaires cytoplasmiques abondants. Le noyau est arrondi, légèrement oval, hétérochromatique et contenant un nucléole. Les fibres de collagène et des dépôts d’élastine sont observés en association avec le soma de la cellule fibroblastique (Figure H5).

Figure H5 : Interaction du fibroblaste cardiaque avec la MEC et un cardiomyocyte. Les fibroblastes et

les mastocytes sont étroitement associés à la vascularisation indiquant une lignée potentielle avec les péricytes et/ou des cellules sanguines. Le schéma global comporte une variété de récepteurs, y compris les intégrines, les cadhérines et les connexines. D’après Baudino et al. 2006.

2.1.5 Le myofibroblaste

Les travaux de Gabbiani et al., 1971 et 1996 ont montré que certains fibroblastes pouvaient présenter des caractéristiques du muscle lisse différencié. Ces « smooth muscle-like cells » sont baptisées myofibroblastes. Ces dernières jouent un rôle dans la croissance, le développement et la réparation tissulaire.

(32)

a) Transdifférenciation du fibroblaste en myofibroblaste

Suite à une lésion, des stimuli mécaniques et chimiques induisent la transdifférenciation des fibroblastes cardiaques en myofibroblastes. Ce nouveau phénotype aux propriétés contractiles et sécrétoires se caractérise par une expression de plusieurs marqueurs des cellules musculaires lisses qui ne sont généralement pas exprimés par les fibroblastes tels que l’α-smooth muscle actin (Tomasek et al., 2002).

Les mécanismes de la transdifférenciation in vivo ne sont pas bien élucidés. Lors de la différenciation, il semble que le profil protéique des fibroblastes change radicalement. Des études in vitro ont montré que durant les stades précoces de la différenciation, les fibroblastes montrent une augmentation de secrétions des protéines d'adhésion indiquant un phénotype proto-myofibroblastique (Baum & Duffy, 2011) (Figure H6). La stimulation provoque une différenciation supplémentaire vers le phénotype myofibroblastique, caractérisé par l’expression spécifique de l’α–SMA (Rohr, 2009) (Figure H6). Les fibroblastes en culture primaire conservent les marqueurs spécifiques uniquement lors du premier passage, alors que les premiers marqueurs de myofibroblastes (paxillin, vincullin et tensin) n’apparaissent qu'à partir du deuxième passage (Santiago et al., 2010).

Cependant, d'autres marqueurs des cellules musculaires lisses, comme la chaîne lourde de myosine (MHC), ne sont pas exprimés dans les myofibroblastes différenciés. Il est à noter que les myofibroblastes peuvent aussi dériver des cellules de la moelle osseuse ou des cellules épithéliales.

La différenciation des fibroblastes en myofibroblastes est favorisée principalement par le TGF- (Transforming growth factor ), les cytokines et la MEC en elle-même (Serini et al., 1998; Walker et al., 2004). Il a été montré que la TGF- augmentait les dépôts de collagène et le taux d’expression de SMA de façon dose-dépendante. En effet, des faisceaux de l’α-SMA sont retrouvés abondants dans les régions à forte concentration de TGF- (Santiago et

al., 2010). Une réduction de 60% de l’α-SMA est observée après inhibition de la TGF- , avec

une diminution de la production de collagène et de la fibrose (Tomasek et al., 2002).

Les caractéristiques principales des myofibroblastes comportent une expression des protéines contractiles, une mobilité plus importante (en comparaison des fibroblastes) et un rôle crucial dans l’intégrité structurelle de la cicatrisation. L’apoptose des myofibroblastes est

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liée à la progression du tissu granulomateux vers la cicatrisation (Brown et al., 2005), d’où leur rôle clé joué dans la fibrose réparatrice dans le cœur post infarctus.

Figure H6 : Les différents rôles du fibroblaste cardiaque. Le fibroblaste cardiaque répond aux stimuli

de différentes façons. Sa réponse comprend la sécrétion de cytokines et de facteurs de croissance, la différenciation en myofibroblaste, la prolifération, la migration et l’altération de la génération de la matrice extracellulaire. D’après Souders et al., 2009.

b) Place des myofibroblastes dans le cœur

A l’exception des valves cardiaques, les myofibroblastes ne font pas partie des cellules du tissu cardiaque physiologique. Cependant, lors d’une lésion, les myofibroblastes apparaissent dans le myocarde et semblent se former à partir des fibroblastes interstitiels et de l’adventice. Il a été également postulé que les myofibroblastes pourraient dériver des cellules souches résidentes dans le cœur ou des cellules souches hématopoïétiques provenant de la

Figure

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