Phase de manipulation

Elle a commencé par l’échantillonnage qui s’est étendu jusqu’au mois d’Août. Il a obéit à deux critères.

 Critères d’inclusion et d’exclusion

L’échantillonnage a inclus tous les patients admis au laboratoire qui ont présenté un bilan lipidique et respecté les conditions requises (au moins 12 heures et 16 heures de jeûne au plus) et exclu ceux qui n’ont pas respecté ces conditions.

 Echantillonnage

125 échantillons ont été utilisés dans la présente étude.

2.3.2.1. Phase pré-analytique

Elle a consisté au prélèvement de sang par ponction veineuse chez les patients admis

au laboratoire avec un bilan lipidique. Les échantillons ont été ensuite centrifugés et les

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sérums recueillis dans les aliquotes et mis au congélateur. Lesdits sérums ont été décongelés au bain-marie à 37°C, le jour de la manipulation, puis dosés au spectrophotomètre d’absorption moléculaire SECOMAM Basic et à l’automate BS- 200 simultanément.

2.3.2.2. Phase analytique

Au cours de cette phase, le dosage du cholestérol total, du HDL cholestérol, des triglycérides et du LDL cholestérol a été réalisé. Le dosage de chaque paramètre a respecté une méthodologie qui lui est spécifique.

 Dosage au spectrophotomètre Dosage du cholestérol total

Le dosage du cholestérol total a été réalisé par la méthode enzymatique au cholestérol Estérase/Oxydase/Peroxydase, méthode de TRINDER, dont le principe est le suivant :

Le cholestéride réagit avec l’eau en présence du cholestérol estérase pour donner du cholestérol et d’acide gras. Ce cholestérol en présence du cholestérol oxydase et de dioxygène donne du choles-4-ène-3-one et du peroxyde d’hydrogène qui réagira avec l’amino-4-antipyrine pour donner un chromogène de couleur rose, quinoneimine, dont l’intensité est proportionnelle à la concentration en cholestérol total.

La longueur d’onde : 500nm (492 – 550nm) a été utilisée, l’eau distillée pour le zéro de l’appareil et la réaction s’est effectuée à 37°C.

Tableau I : Mode opératoire du dosage du cholestérol total

Blanc réactif Etalon Sérum contrôle Dosage

Réactif de travail 1 mL 1 mL 1 mL 1mL

Eau distillée 10µL

Etalon 10µL

Sérum contrôle 10µL

Echantillon (sérum) 10µL

Réalisé par Armel G. AKPAO & Ruth I. N. GBAGUIDI 14 Le mélange homogénéisé a été laissé à température ambiante pendant 10mn. Aucune

interférence majeure n’a été signalée et une linéarité jusqu’à 5g/L a été notée. Les valeurs normales s’étendent (sur du sérum comme du plasma) de 1,50 à 2,60g/L.

Dosage du HDL cholestérol

Principe : Les dosages du cholestérol total et du HDL cholestérol vont souvent de pair.

On réalise une précipitation phosphotungstique. Les lipoprotéines de faibles densités (LDL et VLDL) sont spécifiquement précipitées par l’acide phosphotungstique en présence de magnésium. Après centrifugation, le cholestérol lié aux lipoprotéines de hautes densités (HDL cholestérol) est dosé dans le surnageant. Le HDL en présence du réactif de cholestérol donne un complexe coloré rose dont l’intensité est proportionnelle à la concentration en HDL cholestérol. La longueur d’onde : 500nm (492 – 550nm) a été utilisée, l’eau distillée pour le zéro de l’appareil et la réaction s’est effectuée à 37°C.

Tableau II : Mode opératoire d’obtention du précipité HDLc

Blanc précipitant Sérum contrôle Dosage

Eau distillée 500µL

Sérum contrôle 500µL

Echantillon (sérum, plasma)

500µL

Précipitant HDL 50µL 50µL 50µL

Rigoureusement le mélange a été agité, laissé 10 mn à température ambiante et centrifugé à 5000 trs/mn pendant 15mn. Le surnageant a été délicatement recueilli. Une série de quatre tubes a été disposée pour chaque échantillon.

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Tableau III : Mode opératoire du dosage du HDL

Blanc réactif Etalon Sérum Dosage

Réactif de travail 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL Eau distillée 50µL

Etalon 50µL

Sérum 50µL

Echantillon 50µL

Le mélange homogénéisé a été laissé à température ambiante pendant 10mn. Aucune interférence majeure n’a été signalée et une linéarité jusqu’à 5g/L a été notée avec une limite de détection égale à 0.05g/L. Les valeurs normales s’étendent (sur du sérum comme du plasma) chez l’homme de 0,41à 0,58 g/L et chez la femme de 0,46 à 0,75g/L.

Dosage des triglycérides

Le dosage de triglycérides a été effectué par la méthode enzymatique à la lipoprotéine lipase/ Glycérol kinase/Glycérol -3-phospho oxydase/ Peroxydase. Le principe est le suivant : Les triglycérides sont hydrolysées en présence de la lipoprotéine lipase en glycérol et en acide gras. Le glycérol fixe un atome de phosphate en présence du glycérol kinase et d’ion magnésium pour donner du glycérol-3 –phosphate qui fixera l’oxygène en présence de glycérol-3-phosphate oxydase pour donner le peroxyde d’hydrogène qui suivant la réaction de TRINDER donnera un chromogène de couleur rose dont l’intensité est proportionnelle à la concentration en triglycéride.

La longueur d’onde : 546nm a été utilisée, l’eau distillée pour le zéro de l’appareil et la réaction s’est effectuée à 37°C.

Réalisé par Armel G. AKPAO & Ruth I. N. GBAGUIDI 16 Tableau IV : Mode opératoire du dosage des triglycérides

Blanc réactif Etalon Sérum contrôle Dosage

Réactif de travail 1mL 1 Ml 1 mL 1 mL

Eau distillée 10 µL

Etalon 10 µL

Sérum contrôle 10 µL

Echantillon (sérum) 10 µL

Le mélange homogénéisé a été laissé à température ambiante pendant 10mn. Une linéarité jusqu’à 10 g/L a été notée avec une limite de détection égale à 0.80 g/L et une sensibilité de 0.025 g/L. Les valeurs normales s’étendent (sur du sérum comme du plasma) chez l’homme de 0,60 à 1,65 g/L et chez la femme de 0,40 à 1,40g/L.

Détermination du LDL cholestérol

Il est obtenu par calcul suivant la formule de Friedewald.

 Dosage à l’automate MINDRAY BS-200

Le dosage de CT, des TG et de HDLc s’est effectué suivant les méthodes utilisées au niveau du spectrophotomètre. Le LDLc a été dosé par la méthode directe.

2.3.2.3. Phase post-analytique

Les résultats ont été consignés dans le cahier de paillasse ; le matériel et les réactifs rangés.