La phagocytose

La figure 29A montre que les phagocytes du rein antérieur et ceux de l’intestin ingèrent le même nombre de levures par cellule (2.7 à 3.1 levures en moyenne). Toutefois, le pourcentage de cellules ayant ingéré au moins une levure est trois fois plus élevé dans les suspensions de leucocytes du rein antérieur (45%) que dans celles de leucocytes intestinaux (15% ; Fig. 29B). Cette différence est confirmée par les indices de phagocytose qui sont également significativement différents : 113.3 ± 21.9 et 12.2 ± 1.84 respectivement pour les phagocytes du rein antérieur et les phagocytes intestinaux (figure 29C).

Figure 29 : Activité phagocytaire des leucocytes intestinaux et du rein antérieur. Les leucocytes de l’intestin ou du rein antérieur de truite arc-en-ciel ont été incubés pendant 4 h avec des levures (1 leucocyte pour 20 levures) dans la chambre de culture d'une lame de microscope. Après incubation, les phagocytes sont colorés au May-Grünwald /Giemsa et le nombre moyen de levures ingérées / phagocytes du rein antérieur de l'intestin (A), le pourcentage de phagocytes du rein antérieur ou de l'intestin ayant ingéré au moins une levure (B) ainsi que l'indice de phagocytose (C) des deux suspensions sont mesurés à partir de 200 cellules. Les résultats sont exprimés comme des moyennes ± SEM et les différences significatives sont indiquées par des

Ces observations basées sur l’analyse de 200 phagocytes (macrophages et neutrophiles pour le rein antérieur et juste macrophages pour l’intestin) montrent une différence dans la capacité de phagocytose des cellules de ces deux tissus.

Les indices de phagocytose calculés avec les phagocytes intestinaux ne diffèrent pas en fonction de l’isolement cellulaire utilisé (Figure 30). Et cela même si les phagocytes obtenus par l’isolement digestion ingèrent en moyenne plus de levures que ceux obtenus par l’isolement mécanique (3.1 ± 0.2 et 2.3 ± 0.1 levures par phagocytes respectivement, p=0.03). Par contre, le même pourcentage de phagocytes ayant ingéré au moins une levure est obtenu avec les deux types d’isolement (13.9% ± 1.1 et 12.9 % ± 1.6 respectivement ; p=0.395).

Figure 30 : Indice de phagocytose mesuré à partir de la phagocytose de levures par 200 phagocytes obtenus avec l’isolement digestion et mécanique et collés sur lame. Les résultats sont exprimés comme des moyennes ± SEM. Les tests statistiques ne mettent pas en évidence de différences significatives. (Test de Mann-Whitney, n=7-9 ; p=0.133)

1.3.3 Cytotoxicité naturelle

Les NCC sont capables de détecter et de détruire, entre autres, des cellules infectées par des virus ou des cellules cancéreuses. Lors de cette étude, les activités cytotoxiques des NCC ont été mesurées à trois ratios différents de cellules effectrices par rapport aux cellules cibles : 5:1, 10:1 et 25:1 pour l'intestin et 25:1, 50:1 et 75:1 pour le rein antérieur. Les pourcentages de lyse obtenus à ces ratios sont de 3.79 ± 0.51; 5.20 ± 1.28; 13.2 ± 3.84 pour les leucocytes intestinaux et de 6.25 ± 1.65; 15.1 ± 3.50 et 25.9 ± 4.14 pour les leucocytes du rein antérieur. Nous avons ensuite déterminé les unités lytiques représentant l’activité cytotoxique naturelle de chaque poisson à partir des pourcentages de lyse obtenus aux différents ratios. Les NCC intestinales ont une activité cytotoxique moyenne de 55.0 ± 12.5 unités lytiques alors que l’activité cytotoxique des NCC du rein antérieur correspond en moyenne

à 21 ± 3.52 unités lytiques (Figure 31). Les NCC de l'intestin ont donc une activité cytotoxique deux fois plus élevée que celle des NCC du rein antérieur. Cela signifie qu'un nombre inférieur de NCC intestinaux sont nécessaires pour atteindre le même pourcentage de lyse.

Figure 31 : Cytotoxicité naturelle des leucocytes du rein antérieur et de l'intestin. Les leucocytes sont incubés pendant 2h avec des cellules tumorales P815 à trois ratios de cellules effectrices / cibles différents : 5:1, 10:1 et 25:1 pour les leucocytes intestinaux et 25:1, 50:1 et 75:1 pour les leucocytes du rein antérieur. Les pourcentages de cellules cibles tuées par les cellules effectrices ont été déterminés pour les trois ratios et reportés sur un graphique. La régression linéaire déterminée à partir des pourcentages de lyse obtenus aux différents ratios, a permis la détermination des unités lytiques. Les résultats sont exprimés comme des moyennes ± SEM et les différences significatives sont indiquées par des lettres différentes (a b). (Test de Mann-Whitney, n=6 ; p=0.014)

En parallèle du test cellulaire, nous avons étudié la cytotoxicité naturelle par le biais de la mesure de l’expression du gène codant NKEF, un gène renforçant l’activité des cellules cytotoxiques naturelles. Comme le montre la figure 32, l’expression du gène codant NKEF est cinq fois plus élevée dans les leucocytes de l'intestin que dans ceux du rein antérieur. Il semble donc que l’expression de gène NKEF soit corrélée à l’activité cellulaire mesurée précédemment et que l’activité cytotoxique naturelle soit plus importante dans l’intestin que dans le rein antérieur.

Figure 32 : Expression relative du gène codant NKEF dans les suspensions de leucocytes de l’intestin en fonction de l’expression du même transcrit dans les leucocytes du rein antérieur. Les expressions du gène NKEF ont été normalisée par rapport aux expressions des gènes de références cyclophilline et GAPDH. La moyenne des valeurs relatives obtenues pour l’expression de NKEF dans leucocytes du rein a été fixée à 1. Les résultats sont exprimés comme des moyennes ± SEM et les différences sont indiquées par des lettres différentes (a b). (Test de Mann-Whitney, n=8-12 ; p=0.03).

Concernant la comparaison entre les deux méthodes de purification des leucocytes intestinaux, la figure 33 indique que l’isolement utilisé à une forte influence sur l’amplitude des pourcentages de lyse mesurés. Nous remarquons que les pourcentages de lyse augmentent avec le ratio cellules effectrices : cellules cibles pour les deux isolements. Néanmoins ces pourcentages de lyses sont en moyenne 6 fois plus élevés pour les ratios 5 :1 et 10 :1 et 3 fois plus élevés pour le ratio 25 :1 avec l’isolement mécanique comparé à ceux obtenus avec l’isolement par digestion.

Figure 33 : Pourcentages de lyse obtenus aux ratios 5 :1, 10 :1 et 25 :1 lorsque les cellules cytotoxiques naturelles isolées avec les deux techniques d’isolement sont mis en contact avec les cellules P815. Les résultats sont exprimés comme des moyennes ± SEM et les différences significatives sont indiquées par des lettres différentes (a b, a’ b’, a’’ b’’). (Test de Mann-Whitney,

n=6-9 ; les valeurs de p aux trois ratios sont égales à 73,1.10-5)

Les NCC obtenues avec l’isolement mécanique ont donc une capacité de cytotoxicité naturelle plus importante que celle des NCC obtenues avec l’isolement par digestion. Cette différence peut provenir soit d’une augmentation de la proportion de NCC dans la suspension cellulaire, soit d’une amélioration de l’état physiologique des cellules. En l’absence d’anticorps spécifiques de ce type cellulaire chez la truite, il n’est pour le moment pas possible de quantifier ces cellules dans la suspension par cytométrie en flux. Il serait intéressant dans l’avenir de comparer à nouveau cette fonction intestinale à celle des NCC systémiques en utilisant l’isolement mécanique mais au regard de ces premiers résultats il semble que la cytotoxicité naturelle des NCC intestinaux reste plus forte que celle des NCC du rein antérieur.

1.3.4 Mesure de l’expression de cytokines inflammatoires par biologie moléculaire