Phagocytose des corps apoptotiques

Pour cette étude, nous ne pouvons nous passer de l’utilisation d’un modèle plus physiologique. En effet, les billes de latex, bien que pouvant être assimilées à des corps apopotiques de part leur charge nette négative, ne présentent en aucun cas des signaux aussi complexes qu’une cellule apoptotique. Il nous paraît donc essentiel d’être capable de quantifier l’internalisation de ces dernières. De plus, les RAW264.7 ou les J774.1 sont des macrophages murins, il est fort possible que le comportement des macrophages de rongeurs soit différents de ceux des macrophages humains. Il nous faut donc un modèle de macrophages humains. Nous avons choisi les HL-60.

3.1.2.1 Production de cellules apoptotiques

Avec la collaboration du Dr. Philippe Frachet, nous avons tout d’abord vérifié notre capacité à produire des cellules apoptotiques. L’apoptose des cellules HeLa est induite par un traitement aux ultra-violets, c’est un cas d’induction par la voie interne (dommages à l’ADN) classiquement utilisé. Afin de vérifier l’efficacité de ce traitement sur l’apoptose des cellules, nous marquons ces cellules à l’annexine V pour révéler la présence de phosphatidylsérine à la surface des cellules et à l’iodure de propidium pour vérifier l’intégrité de la membrane. La figure 47 montre les résultats obtenus lors du double marquage de cellules HeLa avant et après traitement aux UV (20h d’incubation). Les résultats montrés sont ceux d’une seule expérience. Nous pouvons observer que 20h après induction aux UV, 50% des cellules sont fortement annexine V positives (région M2). Ces cellules sont de tailles identiques aux

Figure 48 : Phagocytose de corps apoptotiques par les cellules HL-60 différenciées.

Les HL-60 sont marquées par DiI (fluorescence dans le rouge) et les HeLa apoptotiques par DiO (fluorescence dans le vert). Les HL-60 seules (colonne 1), des HeLa apoptotiques (colonne 2) ainsi que les deux types cellulaires après une mise en contact d’une heure à 37°C (colonne 3) sont analysés en fonction de leur morphologie (ligne A), de leur fluorescence dans le rouge et dans le vert (ligne B) ou de leur fluorescence dans le vert en fonction de leur morphologie (ligne C).

cellules viables (groupe 1). Les « cellules » du groupe 2, plus petites sont également positives à l’annexine V (région M1). Cela correspond à environ 20% des cellules. Ce marquage annexine V est presque inexistant sur les cellules avant UV. 20h après induction de l’apoptose, 40 % des cellules annexine V positives sont également perméables à l’iodure de potassium. Ceci laisse supposer que l’intégrité de la membrane est rompue. Ces cellules sont donc en fin d’apoptose voir début de nécrose secondaire. Les UV semblent donc avoir induit l’apoptose même si la population est certainement hétérogène.

3.1.2.2 Test de phagocytose

Le test de phagocytose des corps apoptotiques à été réalisé sur des macrophages humains, des cellules HL-60. Ces cellules peuvent être différenciées en plusieurs types de cellules immunitaires : des polynucléaires neutrophiles avec du DMSO ou en macrophages avec des esters de phorbol (TPA) ou de l’INF-γ. L’utilisation de l’INF-γ ne nous paraissait pas très judicieux. En effet, c’est une cytokine pro-inflammatoire et l’élimination des cellules apoptotiques est réalisée dans un contexte anti-inflammatoire. Nous avons donc utilisé des cellules HL-60 différenciées en macrophage par utilisation des esters de phorbol (notées HL- 60d).

Les cellules HeLa sont traitées aux UV la veille et immédiatement marquées avec DiO (fluorescence dans le vert). Les HL-60d sont marquées par le marqueur de membrane DiI (fluorescence dans le rouge). Les cellules sont mises en contact dans un rapport 1:1 à 37°C pendant une heure, puis centrifugées et reprises dans du PBS-EDTA avant d’être analysées par cytométrie de flux. Les marqueurs membranaires sont décrits dans la littérature pour des tests de phagocytose (Schrijvers et al., 2004).

La figure 48 montre les résultats obtenus pour chaque population cellulaire isolée ainsi qu’après un contact d’une heure. La morphologie des cellules permet de les distinguer selon leur profil SSC-H (figure 48 A1 et A2). Si nous regardons le profil morphologique des cellules après une heure de contact, nous pouvons remarquer que la population cellulaire a un profil FSC-H en augmentation témoignant d’une augmentation de taille des objets analysés. Les profils de fluorescence des cellules HeLa et HL-60d isolées montre que les marquages par DiO et DiI ne sont pas efficaces à 100%, certains objets ne sont pas marqués. Par contre, il y a très peu d’interférence entre les deux marqueurs. En effet, la fluorescence dans le vert du marqueur DiI des cellules HL-60d est très faible. De même, le marquage des cellules HeLa apoptotiques par DiO transfère très peu dans le rouge (figure 48 B1 et B2). Il semblerait donc

Figure 49 :Localisation de Elmo1 dans les cellules RAW264.7 et J774.1

Les cellules sont fixées au paraformaldéhyde 1% puis perméabilisées à l’éthanol 96%. Elles sont incubées ou non avec l’anticorps Elmo1(N-20) puis avec un anticorps secondaire marqué à l’AlexaFluor 488 (vert). Les lamelles sont montées sur lame dans du vectashield-DAPI de façon à marquer les noyaux en bleu. Les temps d’expositions ont été adaptés à chaque type cellulaire mais sont identiques pour les deux conditions.

que la population doublement marquée qui apparaît après contact entre les deux types cellulaires soit bien spécifique de l’expérience. Cette population correspondrait aux cellules HL-60d ayant internalisé des HeLa apoptotiques (figure 48 B3). Finalement, outre le double marquage, nous pouvons aussi visualiser les corps apoptotiques internalisés en analysant la taille des cellules fluorescant dans le vert (figure 48 C1, 2 et 3). En effet, après contact entre les deux types cellulaires, ces cellules ont une taille supérieure à celle des cellules isolées (figure 48 C2 et C3).

Finalement, cette expérience préliminaire montre qu’il est possible d’évaluer la phagocytose des corps apoptotiques au cytomètre de flux de deux manières : en utilisant deux marqueurs de membrane fluorescents ou en marquant uniquement les corps apoptotiques et en regardant l’augmentation de taille. Cette dernière méthode manque de précision car, contrairement aux billes, la fluorescence et la taille des corps apoptotiques ne sont pas répartis de façon discrète rendant une analyse précise difficile. La méthode de double marquage semble la plus précise même si selon les types cellulaires le marquage de membrane peut être très hétérogène. La même expérience réalisée sur des cellules HL-60 non différenciées n’ont pas permis de détecter des cellules phagocytées (données non montrées) ce qui montre que la méthode différenciation utilisée permet bien de différencier les cellules en phagocytes.

Suite à la mise en place de ces tests, il nous fallait choisir un modèle d’étude pour mettre au point les premières techniques. Les cellules HL-60 différenciées, bien qu’intéressantes en tant que modèle humain, se sont montrées difficilement transfectables. Nous avons donc abandonné cette lignée pour l’instant. Nous voulions garder une lignée de phagocytes professionnels afin d’avoir un modèle d’inflammation physiologique, nous nous sommes donc tournés vers les macrophages murins RAW264.7et J774.1.