Phagocytose de billes de latex

3.1.1.1 Mise au point du test

D’après la littérature, les billes de latex portant des groupements carboxylates (2µm) sont de bons modèles pour l’étude de la phagocytose des corps apoptotiques et tout particulièrement pour l’étude du complexe DOCK180-ELMO1 dont la co-surexpression potentialiserait la phagocytose de ces billes (Gumienny et al., 2001; Tosello-Trampont et al., 2007). Nous avons utilisé deux types cellulaires : les HEK293 qui semblent être un bon modèle pour étudier les voies de signalisation de type cellules dendritiques immatures (Albert et al., 2000; Akakura et al., 2004) et les RAW264.7 qui sont des macrophages murins. Ce sont des lignées établies facilement transfectables.

Nous avons donc centrifugé des billes de latex de 2µm de diamètre fluorescant dans le vert (5,7.107 _{billes) avec des cellules à 30% de confluence. En effet, après avoir testé différentes} concentrations de cellules et de billes, les cellules à 30% de confluence avec 5,7.107 billes ont montré un résultat optimal (données non montrées). Les cellules sont ensuite fixées au paraformaldéhyde 1% (PFA) dans du PBS-EDTA et l’ADN est marqué à l’iodure de propidium. Le rôle de l’EDTA est de détacher les billes non internalisées.

La figure 45 (page 158) montre les profils obtenus par cytométrie de flux après une demi heure de contact entre des cellules RAW264.7 et les billes. Les cellules et les billes isolées peuvent être séparées en fonction de leurs morphologies. Cela permet d’analyser les profils de

Figure 45 : Phagocytose de billes de latex par les cellules RAW264.7.

4,5.107 billes sont centrifugées sur des RAW264.7 puis incubées 30mn à 37°C. Les cellules sont fixées au PFA1% puis l’ADN est marqué à l’iodure de propidium. Les résultats sont analysés par cytométrie de flux. Les chiffres indiquent le nombre de billes. Les chiffres, profils ou cadres en rouge correspondent à la population des cellules et les indications en vert foncé aux billes isolées. A. Morphologie des objets. B. Profil de fluorescence vert (FL1-H) et rouge (FL2-H) des objets. C. Répartition des objets en fonction de leur fluorescence dans le vert. D. Répartitions des objets en fonction de la fluorescence dans le rouge.

Figure 46 : Cinétique d’internalisation des billes par les RAW264 et les HEK293.

A. Les diagrammes présentent uniquement les événements correspondant aux cellules. Les temps d’incubation sont précisés dans chaque cadre et les pourcentages correspondent au pourcentage d’objets sélectionnés fluoresçant à la fois dans le rouge et dans le vert. B. Cinétique d’internalisation des billes au cours du temps pour les HEK 293 (rouge) et les RAW264.7 (bleu). Les barres verticales indiquent les écart-types sur 2 (HEK293) à 3 expériences (RAW264.7).

fluorescence de chaque population (figure 45A). La population « billes isolées » (en vert) peut être séparée en sous-populations en fonction du nombre de billes par objet à la fois dans le profil FSC-H/SSC-H (figure 45A) mais aussi dans le profil de fluorescence (figure 45B et C). Nous confirmons également une absence de fluorescence dans le rouge (figure 45D). La population « RAW264.7 » (en rouge) est bien entièrement marquée au PI et révèle un profil ADN classique avec des cellules contenant 2n chromosomes dans le pic a et 4n chromosomes dans le pic b (figure 45D). Il a été vérifié que ces cellules ne fluorescent pas dans le vert en absence de billes (données non montrées). Par contre, en présence de bille, certaines fluorescent dans le vert et la fonction de répartition de cette fluorescence est discrète, il est possible de distinguer plusieurs sous-populations : sans fluorescence, avec la fluorescence d’une bille, de deux billes ou de plus de deux billes (figures 45B et C). De plus, nous pouvons observer que la fluorescence des billes associées aux cellules est légèrement plus faible que celle des billes isolées témoignant d’une internalisation de celles-ci (figure 45C).

Ces résultats montrent que nous sommes capables d’identifier les cellules ayant internalisé ces billes ainsi que le nombre de billes par cellule. Les expériences réalisées avec les cellules J774.1 ou les HEK293 donnent le même type de résultats (données non montrées). Dans la suite, les pourcentages de phagocytose correspondront au pourcentage de cellules ayant internalisé des billes. La vitesse du flux entrant de billes dans une cellule peut être estimé en établissant la cinétique de phagocytose au cours du temps.

3.1.1.2 Cinétique de phagocytose

Etablir une cinétique peut être important pour choisir un temps de phagocytose optimal mais aussi pour vérifier que l’internalisation augmente avec le temps et donc que le processus est actif. Les cellules sont incubées à 4°C avant l’ajout des billes de façon à fixer le t = 0min de l’expérience. La réaction est arrêtée en remplaçant le milieu de culture par du PBS froid. Le temps d’incubation varie entre 0min et 90min.

La figure 46 montre les cinétiques d’internalisation. Le nombre de cellules RAW264.7 fluorescant à la fois dans le vert (billes) et dans le rouge (ADN) augmente au cours du temps comme le montrent les résultats obtenus par cytométrie (figure 46A). Ceci laisse supposer que le double marquage est le résultat d’un processus actif. Ceci a été confirmé par une expérience d’une heure et demie à quatre degré avec les cellules HEK293 qui a montré une chute du nombre de cellules doublement marquées de 28% (données non montrées). Les cinétiques ont

Figure 47 : Marquage Annexine V/PI de cellules HeLa

Des cellules HeLa sont, ou non, traitées aux UV (1000J.cm-2_{) puis incubée 20h à 37°C. Les cellules} sont marquées à l’annexineV-FITC, qui marque les cellules apoptotiques, et à l’iodure de propidium, qui marque l’ADN des cellules perméables. A. Morphologie des cellules HeLa non irradiées. B. Morphologie des cellules HeLa irradiées. C. Marquage annexine V des HeLa non irradiées (orange) des HeLa irradiées (vert pour les cellules de G1 et bleu pour les cellules de G2). D. Marquage de l’ADN. E. Marquage ADN et annexine des cellules HeLa non irradiées. F. Marquage ADN et annexine V des cellules irradiées.

la même allure pour les deux types cellulaires testés mais le taux d’internalisation est supérieur pour les HEK293. De plus, les écarts-types obtenus, même sur très peu d’expérience, laissent supposer une bonne reproductibilité des résultats.

Le test de quantification de l’internalisation de billes fonctionne, et ce, sur différentes lignées cellulaires : des HEK293 assimilables à des cellules dendritiques immatures (mais moins efficaces), des macrophages murins avec un faible taux d’internalisation les RAW264.7 et des macrophages murins avec un fort taux d’internalisation, les J774.1. Ces différents comportements en phagocytose des cellules pourraient être liés à des variations d’expression ou de modifications post-traductionnelles des protéines qui nous intéressent, ou des variations dans leurs partenaires par exemple.