As análises realizadas para cada fermentação foram de biomassa, pH e quantidade de acetoína e diacetil. Nos experimentos em erlenmeyer foram retiradas 1 a 4 amostras de 2 mL, por pipetagem; nos experimentos em fermentador, foram retiradas amostras de 4 a 20 mL através da saída de amostragem. Os intervalos de amostragem foram aumentados ou diminuídos, de acordo com o aspecto da curva de variação de absorbância (que foi determinada ao longo da fermentação). Os intervalos foram de 20 a 30 min na fase lag e 30 a 60 min nas outras fases.
3.3.1 Determinação da concentração celular
A concentração celular foi acompanhada através de medição direta por gravimetria (massa seca) para os experimentos em shaker, e por medição indireta (absorbância a 550 e a 700nm) para os
3.3.2 M assa seca
Amostras de 50 mL do fermentado de cada experimento eram filtrados através de uma membrana de 0,45 ^m (Millipore) de massa seca conhecida; a membrana com as células retidas era posta a secar a 100-105°C por 12h e pesada novamente; a massa da membrana, subtraída da massa total dá a massa seca de células, dònde foi possível calcular a concentração de biomassa (em massa seca) do fermentado. Para os experimentos em erlenmeyer, os filtrados foram guardados sob refrigeração para eventuais análises posteriores.
3.3.3 M edidas de absorbância
Foram feitas usando 2 a 4 mL de fermentado, sempre a 550 nm e em vários casos a 700 nm para efeitos de comparação, usando um espectrofotômetro (CELM E225D) com cubetas de vidro de lcm de diâmetro. Amostras com absorbâncias muito altas (acima de 0,800) foram diluídas 1:2 ou 1:3. Para algumas curvas de crescimento não se fez diluição, medindo absorbâncias da ordem de 1,5, com conseqüente aumento da incerteza na medição. Essas absorbâncias foram convertidas em massa seca de células por volume de solução através de equações obtidas por regressão polinomial dos pontos de uma curva de calibração.
A curva de calibração foi feita por diluições sucessivas de uma amostra do fim da fermentação, em água destilada e em meio estéril, para comparação, e se leu a absorbância a 550nm. Sabendo o valor da diluição, poderia se atribuir à absorbância de cada amostra a massa seca equivalente (por exemplo, se a amostra fmal continha 5 g/L de biomassa seca, uma amostra diluída 1:10 cuja absorbância seja 0,497 possui 0,5 g/L de biomassa seca, e uma amostra de fermentação de absorbância 0,5 deve ter aproximadamente 0,5g/L de sólidos). Nota-se que as curvas para diluição com água e com soro podem ser igualmente utilizadas para a determinação de uma expressão de concentração em função da absorbância (Figura 3.1). A expressão foi calculada, então, usando os dados das diluições com água.
Figura 3.1 - Curva de calibração para a determinação da concentração de células secas (X) através da absorbância
A expressão que se ajusta adequadamente aos pontos experimentais, obtida por mínimos quadrados é X = — 0,066 + 0,898.abs - 0,795.(abs)2 + 0,696.(abs)3
3.3.4 Determinações de pH
O pH dos meios de cultivo foi determinado usando um pHmetro (DMPH-2, Digimed) para medidas de maior precisão, e indicadores ácido-base do tipo strip-test (CARLO ERBA) para estimativas da acidez ou basicidade.
3.3.5 Concentração de diacetil e acetoína
Para a determinação da concentração de diacetil e acetoína, foi usado o método baseado na reação de Voges-Proskauer, como descrito em (OUGH e AMERINE, 1988) com pequenas modificações:
Soluções necessárias:
Solução de a-naftol: 5g de a-naftol em lOOmL de isopropanol. A solução foi descolorizada pela adição de ca. 0,5g de carvão ativo, agitada por 30 minutos e filtrada em filtro de papel. A solução deve ser guardada ao abrigo do ar e da luz.
Solução estoque de diacetil: 10mg/L de diacetil em água. Solução estoque de acetoína: 200mg/L de diacetil em água
Método de análise:
A um tubo de ensaio, adiciona-se 0,4mL da solução de a-naftol e 0,4mL da solução de KOH- creatina; a essas soluções, adiciona-se 2 mL da amostra de fermentação, agita-se e adiciona-se 50|j.L de n-hexano. Para amostras contendo soro de leite, centrifugar após adição dos reagentes por 1 min. a 1000 g. Ler a absorbância a 550 nm após 2 min. da adição dos reagentes e novamente após lh da adição dos reagentes. É conveniente agitar gentilmente a amostra uma ou duas vezes durante esse intervalo de lh. O valor lido a 2 min é tomado como a absorbância devida ao diacetil, e o valor lido a lh é tomado como devido à acetoína. É necessário corrigir os valores de absorbância com um branco (o meio de cultura estéril, por exemplo).
A absorbância a 550 nm é convertida em acetoína e diacetil equivalente através de curvas de calibração obtidas da leitura, pelo mesmo método, da absorbância a 550 nm usando amostras diluídas das soluções estoque.
Para a acetoína, a reação é extremamente dependente do tempo (Figura 3.2), daí a necessidade de esperar algum tempo, tanto para a reação se completar quanto para a quantidade de produto se estabilizar.
Figura 3.2 - Curva de calibração para determinação da concentração de acetoína através da absorbância. Note-se a diferença entre as leituras após 5min e após lhora.
Usando a faixa aproximadamente linear do gráfico, para leituras após 1 hora, a expressão que dá a concentração de acetoína em função da absorbância, a partir dos dados representados no gráfico, é: Acetoína (ppm) = 9,139*abs -1,2836, com R = 0,999. A expressão é válida até concentrações de cerca de 12 ppm de acetoína.
Para o diacetil a reação é bem mais rápida, de forma que a leitura é feita antes (e a estabilização da cor ocorre antes também). Para pequenas concentrações de diacetil, a absorbância da amostra varia linearmente com a variação de concentração (vide Figura 3.3)
Figura 3.3 - Curva de calibração para determinação da concentração de diacetil através da absorbância.
A expressão que dá a concentração de diacetil em função da absorbância da amostra, a partir dos dados representados no gráfico, é Diacetil(ppm) = 12,01. Abs -1,9305, com R = 0,997.