membranaire induite par des sels d’alkylbiguanidium
2.1 Préface
Lorsque nous avons commencé ce projet, très peu d’informations étaient présentées dans la littérature pour nous permettre de comprendre l’action des biguanides et des sels de biguanidium sur les membranes. Avant de commencer la synthèse de molécules plus complexes, nous nous sommes donc penchés sur l’étude des composés très simples, les sels d’alkylbiguanidium. Notre but en étudiant ces composés était de comprendre les paramètres requis pour faire pénétrer les sels de biguanidium plus facilement dans l’environnement hydrophobe de la membrane, et comment la perméabilisation de celle-ci allait influencer leurs propriétés biologiques. L’utilisation des chaines alkyles simples comme groupements fonctionnels nous a permis d’isoler l’effet de l’hydrophobie sans que l’assemblage supramoléculaire de ces composés ne vienne modifier leur capacité d’insertion dans les bicouches lipidiques.
Ce chapitre présente ainsi la synthèse de sels d’alkylbiguanidium, ainsi que leurs propriétés de perméabilisation, de transport d’ions et de dépolarisation des membranes. Les propriétés antibactériennes ainsi que la toxicité hémolytique qui découlent de cette perturbation sont aussi décrites.
Ma contribution à l’article présenté dans ce chapitre a été l’élaboration du projet et des procédures, la totalité du travail expérimental ainsi que la rédaction de la première version du manuscrit. Le Dr. Maxime Parisotto et Prof. Gerardo Ferbeyre ont contribué à cet article dans l’élaboration du projet. La Prof. Andreea R. Schmitzer a assuré la supervision du projet, contribué à l’élaboration du projet et des procédures expérimentales, ainsi que la finalisation de la rédaction du manuscrit.
2.2 Concepts et méthodes utilisées
2.2.1 Transport d’ions
Afin d’étudier les propriétés de transport des sels d’alkylbiguanidium, nous avons utilisé deux essais très courants dans le domaine des transporteurs synthétiques. Le premier étudie le transport d’ions chlorures à travers la membrane de liposomes de EYPC et utilise la lucigénine comme sonde fluorescente (fig. 2.1), dont l’intensité de fluorescence est dépendante de la concentration en ions chlorures1. En encapsulant cette sonde dans des liposomes contenant une
forte concentration en Cl-, la majorité de la fluorescence de la lucigénine est éteinte. L’ajout
d’un transporteur d’ions actif dans la solution extravésiculaire permet de faire sortir les Cl- hors
du liposome, ce qui se traduit par une augmentation de la fluorescence de la lucigénine. Cette variation peut être suivie en temps réel pour obtenir la cinétique de transport ainsi que d’autres données pertinentes, tel que le EC50 (concentration de transporteur nécessaire pour le transport
de la moitié d’ions chlorures) ou le coefficient de Hill, qui décrit la coopérativité des molécules lors de ce processus2-3.
Figure 2.1 Sondes fluorescentes utilisées pour les études de transport d’ions
Le deuxième essai utilise le 8-hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonate de trisodium (HPTS) encapsulé d’une façon similaire dans des liposomes de EYPC (fig. 2.1)2. La sonde HPTS
possède deux longueurs d’ondes d’excitation différentes, 403 nm pour sa forme protonée et 460 nm pour sa forme déprotonée, à la même longueur d’onde d’émission. Il est ainsi possible de
calculer le pH dans l’environnement de la sonde – soit l’intérieur du liposome – avec le rapport d’intensité de ces deux longueurs d’ondes selon la formule suivante :
𝑝𝐻 = 7.3 − log (𝐼 ⁄𝐼 )
Cette expérience permet de déterminer l’efficacité du transport d’ions H+/OH- par un composé
ajouté au milieu extravésiculaire.
2.2.2 Dépolarisation des membranes
Le transport d’ions à travers une membrane biologique peut avoir de graves conséquences pour un organisme vivant, entres autres à cause de la dépolarisation de celle-ci. Afin de déterminer l’effet des sels alkylbiguanidium sur le potentiel de membrane des liposomes, nous avons utilisé la safranine-O, une sonde fluorescente cationique et lipophile dont la fluorescence varie en fonction du potentiel de la membrane (fig. 2.2)4. Nous avons utilisé
cette sonde dans un système de liposomes contenant des ions K+ et baignant dans une solution
avec des ions Na+. De cette manière, un petit potentiel membranaire est généré et la safranine-
O est légèrement fluorescente au début de l’expérience. En ajoutant un composé capable de modifier ce potentiel, la fluorescence de la safranine-O change, ce qui permet de suivre par fluorescence les variations du potentiel membranaire.
Figure 2.2 Sondes fluorescentes utilisées pour les études de dépolarisation
Une expérience très similaire fut utilisée sur des membranes bactériennes plus complexes5. Après avoir été retirées du milieu de croissance, des bactéries furent incubées avec
la sonde iodure de 3,3’-diethylthiadicarbocyanine (DiSC2(5)) pour qu’elle s’incorpore dans leur membrane externe (fig. 2.2)6. La fluorescence de cette sonde est éteinte dans les membranes
bactériennes polarisées mais augmente fortement lorsque ce potentiel est détruit. Encore une fois, cette expérience permet de suivre la cinétique de dépolarisation membranaire en temps réel.
2.2.3 Perméabilisation de la membrane bactérienne
Afin de déterminer l’effet des biguanides sur la perméabilisation des membranes bactériennes, nous avons utilisé des E. coli MG1655 exprimant l’enzyme β-galactosidase dans le cytosol et baignant dans une solution d’ortho-nitrophényl-β-galactoside (ONPG)7. L’ONPG
est habituellement incapable de diffuser au travers des bicouches lipidiques, mais la présence d’agents perturbateurs de membranes lui permet de pénétrer à l’intérieur de la bactérie et de se faire hydrolyser dans le cytosol par la β-galactosidase en ortho-nitrophénolate (ONP), un composé coloré. En suivant l’absorbance de la solution par UV-vis à 420 nm, il est possible de suivre directement la perméabilisation de la membrane bactérienne par un agent perturbateur (fig.2.3).