Performances de la RT-PCR M quantitative et optimisation

1.1.2.1. Performances de la technique

L’efficacité de l’amplification traduit la proportion de séquences amplifiées doublant à

chaque cycle et se calcule à partir de la pente de la courbe d’étalonnage [log (charge virale)= f (Ct)] selon la formule suivante :

Efficacité de PCR= 10 ^{(-1/ pente)} – 1

Ella a été déterminée à partir de 28 essais. Dans chaque essai, une gamme de transcrit M de 6 points (10-10⁶ copies/5µl) a été ajoutée en duplicate. Nous avons montré une forte corrélation entre le Ct et la charge virale (R² moyen= 0.99 ± 0.01) et une efficacité de PCR comprise entre 86,6 et 98,6% (publication 1, tableau 2, page 319).

La limite de détection a été déterminée en testant 20 fois les trois points de gamme les plus

bas (10¹, 10² and 10³ copies/5µl) (publication 1, tableau 3, page 319). La probabilité de détecter 10³ et 10² copies était de 100% alors que celle de détecter 10 copies était de 35%. En fonction du facteur de concentration de l’étape de purification de l’ARN, une limite de

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détection comprise entre 10 et 10² copies/5µl correspond à la détection de 700 à 7000 copies/ml de génome viral dans le prélèvement de départ.

La répétabilité ou précision intra-essai a été calculée en testant 6 échantillons positifs (Ct

moyen = 28,18) et 3 échantillons faiblement positives (Ct moyen = 37,11). La déviation standard calculée était de 0,07 ± 0,04 pour les échantillons positifs et de 0,79 ± 0,19 pour les échantillons faiblement positifs (publication 1, tableau 4, page 319).

La reproductibilité ou précision inter-essais a été évaluée en testant deux échantillons

positifs (Ct moyen = 29,92) et un échantillon faiblement positif (Ct moyen = 36,43) trois fois, dans trois essais, réalisés trois jours différents. La déviation standard calculée était de 0,16 ± 0,02 pour les positifs et de 0,39 pour les faiblement positifs (ligne de base de fluorescence dRn 0,2)

(publication 1, tableau 4, page 319).

La spécificité de la qRT-PCR M a été déterminée vis à vis de nombreux virus respiratoires ou

présents dans la sphère nasopharyngée : virus influenza saisonniers A(H1N1) et A(H3N2), A(H1N1)2009, virus influenza aviaires A(H5N1) et A(H5N2), virus influenza B, virus influenza C, virus respiratoire syncytial (VRS), bocavirus (hBoV), parainfluenza virus 1 et 3 (hPIV), metapneumovirus (hMPV), rhinovirus (hRV), enterovirus, adenovirus, cytomegalovirus (CMV), herpes simplex virus (HSV) et virus de la varicelle et du zona (VZV). Seuls les virus influenza A [A(H1N1), A(H3N2), A(H1N1)2009, A(H5N1) et A(H5N2)] ont été détectés mais aucun signal n’a été observé pour les autres virus testés. Nous avons aussi vérifié qu’il n’y avait pas de signal positif avec les cellules utilisées pour la culture du virus influenza (MDCK) (données non publiées) et que la RT-PCR M pouvait détecter un large panel de virus aviaires de type A et de sous-types variés (Tableau 8).

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Tableau 8: panel de virus influenza A de sous-types variés détectés par la RT-PCR M

Origine du virus Sous-type viral Nom de la souche testée

H2N3 A/Duck/Germany/1215/73 H3N8 A/Duck/Ukraine/1/63 H4N6 A/Duck/Czech/1/56 H5N1 A/Turkey/16/2006 H5N2 A/Finch/England/2051/2002 H6N1 A/Duck/Germany/1868/68 H7N1 A/Chicken/2676/99 H7N3 A/Turkey/England/1239/63 H8N4 A/turkey/Ontario/6118/68 H9N2 A/Chicken/Hong Kong/69/97 H10N8 A/Quail/Italy/1117/65 H11N6 A/Duck/England/1120/56 H12N5 A/Duck/Alberta/60/76 H13N6 A/Gull/Maryland/704/77 Aviaire H15N8 A/Duck/Australia/348/83 Equine H7N7 A/Equine/Prague/56 H1N1 A/New Caledonia/20/99 A/Solomon Islands/03/2006 A/Brisbane/59/2007 H3N2 A/Moscow/10/99 A/California/07/2004 A/Wisconsin/67/2005 A/Brisbane/10/2007 A/Uruguay/716/2007 A/Perth/16/2009 humaine H5N1 A/Vietnam/1194/2004

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1.1.2.2. Optimisation de la technique

Développement des plamsides qNC et qH5

L’utilisation en mode quantitatif de la RT-PCR proposée par Whiley et al ¹¹⁴ nous imposa de produire un plasmide contenant la séquence cible de la RT-PCR. Pour les applications que nous avions, nous avons développé en parallèle deux plasmides qNC et qH5 contenant, respectivement, les séquences cibles, reconnues par la RT-PCR M, d’un virus humain A(H1N1) : A/New Caledonia/20/99 et du virus aviaire A(H5N2) A/Finch/England/2051/02.

Les plasmides qNC et qH5 ont été produit par clonage, dans un vecteur pBluescript SK (+/-) « Multiple Cloning Site Region » (Stratagène), des séquences partielles du segment M ayant pour taille, respectivement 574 pb et 1100 pb. Après linéarisation, dosage spéctrométrique et calcul du poids moléculaire, nous avons obtenus deux stocks de plasmide qui avaient pour concentrations, 10⁹ copies/ 5µl pour qNC et 10¹¹ copies/5µl pour qH5.

Composition du mélange réactionnel

Le développement de la RT-PCR M quantitative s’est fait en plusieurs étapes. Nous avons évalué la RT-PCR publiée par Whiley et al ¹¹⁴ dans les conditions du kit SuperScript™ III Platinum® One-Step Quantitative RT-PCR System (Invitrogen), en testant différents mélanges réactionnels contenant des quantités variables d’amorces (800 nM ou 900 nM) et de sonde (200 nM ou 300 nM). Nous avons déterminé les conditions permettant d’obtenir la meilleure efficacité (plus petit Ct et plus grande intensité de fluorescence (dRn) pour une quantité déterminée de cible) et une sensibilité satisfaisante (meilleure capacité à détecter la plus petite concentration de plasmide). Cette évaluation nous a permis de choisir le protocole utilisant 800 nM de chaque amorce et 200nM de sonde. Nous avons complété le panel de virus influenza A qui avait été testé par Whiley et al.¹¹⁴ (H1N1, H3N2, H5N1, H5N3, H7N7 et H9N2) et nous avons montré que la RT-PCR M détectait un large éventail de virus influenza A aviaires et équins (Tableau 8).

Adaptation de la qRT-PCR M sur LC480 et SmartCycler

Dans le cadre du protocole national BIVIR dans un premier temps, et du début de la pandémie ensuite, les deux CNR (sud et nord) ont souhaité uniformiser leur techniques de détection et de quantification du virus influenza. Après évaluation des outils à disposition, les CNR ont

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fait le choix de la RT-PCR M quantitative que nous avions développé et de l’utilisation du transcrit ARN que le CNR nord avait produit comme matériel quantifié, pour la réalisation de la gamme. Le transcrit ARN présente comme intérêt majeur, par rapport au plasmide ADN que nous avions développé, de permettre par sa nature ARN d’évaluer aussi l’étape de transcription inverse en plus de celle de PCR. Le transcrit est un ARN de polarité négative produit in vitro à partir de la souche A/Paris/650/06 (H1N1). Il contient le début de la séquence codante du gène M, de l’ATG au nucléotide 982.

Dans un second temps nous avons adapté la technique sur les plateformes d’amplification du LC480 (Roche Diagnostic) et du SmartCycler (Cepheid). Nous avons testé différentes concentrations d’amorces et de magnésium (MgSo4^2- ) et évalué le mélange réactionnel le plus performant pour obtenir les mêmes Ct/Cp sur LC480 (Roche Diagnostic) et SmartCycler (Cepheid) que sur la plateforme sur laquelle nous avons travaillé : ABI7500 (Applied Biosystem), pour chacun des points de gamme de transcrit ARN.