La technique d’électrophysiologie permet d’enregistrer les courants électriques membranaires générés lors de la transmission synaptique, puis de déterminer quels compartiments pré- et post-synaptiques et/ou quels acteurs protéiques (récepteurs, transporteurs, …) peuvent être à l’origine d’éventuelles modifications du signal. La technique électrophysiologique de patch-clamp en configuration « cellule entière » est la technique de choix pour l’étude macroscopique des courants membranaires. Cette technique consiste à mettre en continuité électrique une micropipette de verre, remplie d'une solution ionique de composition définie avec l’intérieur de la cellule enregistrée comme illustré en figure 18. Nous avons utilisé cette technique afin d’enregistrer les courants post-synaptiques, excitateurs et inhibiteurs, en condition de potentiel (‘voltage’) imposé.
Deux types de courants ont été étudiés : les courants spontanés et les courants miniatures. Chacun des courants a été mesuré au niveau du soma du neurone.
Les courants spontanés proviennent de la libération de neurotransmetteurs induite par les potentiels d’actions (PA) pré-synaptiques (Fig 19).
Les courants miniatures proviennent de la libération aléatoire de neurotransmetteurs dans la fente synaptique sans induction préalable par des potentiels d’actions. Pour les mesurer, on réalise un traitement à la tétrodotoxine (TTX) qui permet l’inhibition des courants sodiques responsables de la genèse des PA (Fig 19).
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Figure 18 : Schéma explicatif de la technique d’enregistrement électrophysiologique sur
cellule entière
A: Schéma du dispositif expérimental reliant la cellule enregistrée via une électrode à un
amplificateur puis à un ordinateur. Une électrode de référence permet de mesurer les
différences de potentiel avec le milieu externe.
B: Représentation en microscopie à transmission (Contraste de phase) de neurones en
culture, l’un d’eux étant en contact direct avec une électrode.
C: Schéma de l’évolution entre la configuration « cellule attachée » où l’électrode est apposée
à la cellule et, après succion (au sens propre), la configuration « cellule entière » où l’intérieur
de l’électrode est en contact avec l’intérieur de la cellule.
D: Schéma représentatif d’un neurone enregistré représentant les connexions synaptiques
entre les dendrites et l’axone de ce neurone et les neurones adjacents.
A
B
10µm Ordinateur Amplificateur Electrode Electrode de référence CelluleCellule attachée
Cellule
entière
Succion
Analyse des tracés par le logiciel AxoGraph.
Paramètres étudiés : Fréquence d’apparition des événements et Amplitude des évènements.
Courant ionique NMDA : inhibition AMPA et GABA (CNQX et Bicuculline)
Courant ionique AMPA : inhibition NMDA et GABA (APV et Bicuculline)
Courant ionique GABA : inhibition NMDA et AMPA (APV et CNQX)
Courants spontanés :
Courants miniatures :
Conditions identiques + Tétrodotoxine (TTX)
Tracés types
Enregistrements analysés par AxoGraph
AMPA au cours de la maturation
GABA-A
J5
J7
J8
J9
GABA
Fig 19: Illustration des courants enregistrés.
A: Illustration des tracés types de courants excitateurs et inhibiteur (sur la partie de gauche),
utilisés par le logiciel Axograph pour repérer les caractéristiques de ces courants dans les
tracés bruts (représentés sur la partie droite) pour les AMPA en fonction du temps en culture
et pour les GABA à J9.
B: Description des conditions expérimentales permettant l’enregistrement des courants
individuels spontanés et miniatures.
A
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Exemple des courants AMPA
Fig 20: Illustration de l’analyse par Axograph des courants enregistrés.
A: Exemple des courants AMPA enregistrés pendant 210 secondes.
B: L’analyse des courants par Axograph est basée sur l’utilisation d’un patron (template),
configuré pour repérer les courants d’un type donné, illustré ici par le patron AMPA, sur un
agrandissement du tracé premier. A partir d’un point donné (illustré ici en vert), le tracé des
courants est analysé pendant un temps donné (indiqué par un trait rouge parallèle à
l’abscisse) pour déterminer l’amplitude de chaque événement ainsi que l’intervalle de temps
entre deux évènements successifs.
A
20pA10s
Chaque évènement identifié comme ‘courant AMPA’ est repéré par un point vert initial et souligné d’un trait rouge. L’amplitude de chaque événement est mesurée ainsi que l’intervalle de temps entre deux évènements (IEI).
B
Patron d’un évènement type ‘courant AMPA’ (template) utilisé par le logiciel AxoGraph.logiciel AxoGraph. L’analyse par le logiciel AxoGraph permet de détecter les courants électriques (évènement) provenant de l’ouverture des canaux ioniques, d’évaluer l’intervalle de temps entre chaque évènement ainsi que leur amplitude, comme l’illustre la figure 20. L’ouverture de canaux de type NMDA, AMPA et GABA (pour se limiter à ceux que nous avons enregistrés) déclenche un courant dont le tracé en fonction du temps répond à des critères de cinétique d’ouverture et de fermeture, et d’amplitude bien particuliers qui ont été modélisés sous forme de patron (template), illustré figure 20B pour le tracé type AMPA. Ce patron permet de déterminer l’occurrence de ces courants sur une période donnée ainsi que leur amplitude.
Les résultats des analyses ont été représentés par un graphique de la distribution des fréquences cumulées de chacun des paramètres étudiés c’est-à-dire, ici, l’intervalle de temps entre deux évènements et l’amplitude des évènements. Cette représentation permet de mettre en évidence la distribution statistique des caractéristiques (fréquence ou amplitude) des courants enregistrés. En complément, un des critères utilisés est la moyenne de la fréquence d’apparition des courants ou de leur amplitude. De fait, le seul critère de moyenne, s’il peut être informatif en cas de variation importante entre deux situations expérimentales, ne permet pas de rendre compte de variations discrètes de distribution réservée à une sous-partie de l’échantillonnage. Un critère supplémentaire d’analyse que constitue le nombre total d’évènements est en cours d’analyse. Nous présenterons donc systématiquement les moyennes aux côtés des distributions cumulatives de fréquence.
Nous nous sommes intéressés dans un premier temps à la transmission excitatrice glutamatergique traduite par les courants entrants des récepteurs canaux NMDA et AMPA et, dans, un second temps, à la transmission inhibitrice traduite par les courants GABA.