1. Conception et caractérisation physico-chimique des complexes à
base de chitosan
1.1 Produits commerciaux
L’ensemble des produits commerciaux utilisés au cours de ce travail sont listés dans le tableau suivant :
Produit N° CAS Fournisseur Pureté
Chitosan (origine animale) 9012-76-4 Sigma-Aldrich Degré de désacétylation : 85% Chitosan 10-20 kDa (origine végétale)
9012-76-4 Pierre Fabre Degré de
désacétylation : non fourni Chitosan 50-80 kDa
(origine végétale)
9012-76-4 Pierre Fabre Degré de
désacétylation : non fourni
Acide oléique 112-81-1 Sigma-Aldrich ≥ 99%
Acide linoléique 60-33-3 Sigma-Aldrich ≥ 99%
Acide α-linolénique 463-40-1 Sigma-Aldrich ≥ 99%
Acide stéarique 57-11-4 Sigma-Aldrich ≥ 95%
Acide lactobionique 96-82-2 Sigma-Aldrich 97%
Acide kojique 501-30-4 Sigma-Aldrich Non fournie
Acide azélaïque 123-99-9 Sigma-Aldrich 98%
R000342 85-27-8 Pierre Fabre Non fournie
Acide rétinoïque 302-79-4 Pierre Fabre Non fournie
n-butyl résorcinol 18979-61-8 Sigma-Aldrich Non fournie
Tableau A-1 : produits commerciaux utilisés
1.2 Solvants
Partie expérimentale
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Nom du solvant N° CAS Fournisseur Pureté
Acide chlorhydrique 7647-01-0 SDS 1N
Acide acétique 64-19-7 VWR 100%
Ethanol 64-17-5 VWR 95%
Tableau A-2 : liste des solvants utilisés au cours des travaux
1.3 Techniques générales de caractérisation structurale
1.3.1 Résonance magnétique nucléaire (RMN)
Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker® Avance fonctionnant à 500 MHZ équipé d’une cryosonde TCI de 5 mm. Toutes les expériences ont été réalisées à la température de 25°C. Les expériences ont été enregistrées avec les paramètres suivants :
RMN 1H
- Accumulation : 16 scans
- Délai de relaxation : 8,3 secondes Jmod 13C
- Accumulation : 6000-8000 scans - Délai de relaxation : 3,4 secondes DOSY
Les expériences de DOSY ont été réalisées avec les conditions suivantes : - Temps de diffusion : 100 ou 800 ms
- Durée de gradient : 1ms ou 6 ms - Nombre de gradients : 16
- Nombre de scans : entre 16 et 32
Les déplacements chimiques sont exprimés en partie par million (ppm) par rapport au tetraméthylsilane. Les fréquences sont exprimées en hertz (Hz).
Les spectres ont été réalisés pour des concentrations de 30 à 60 mg/ml.
NB : les abréviations suivantes sont utilisées pour décrire la multiplicité des signaux obtenus sur le spectre RMN du proton : « s » pour singulet, « d » pour doublet, « t » pour triplet, « q » pour quadruplet et « m » pour multiplet.
199
1.3.2 Spectroscopie Infra-Rouge (IR)
Les spectres infra-rouge (IR) ont été enregistrés par un appareil Perkin Elmer® FT-IR 1760-X. les échantillons solides ont été préparés en pastille de bromure de potassium (KBr) avec une concentration massique de 0,5%.
1.4 Techniques générales de caractérisation physico-chimique
1.4.1 Microscopie électronique à transmission (MET)
La microscopie électronique à transmission (MET) est une méthode basée sur l’effet d’écran que peut produire un objet soumis à un faisceau d’électrons. L’objet est placé sur une grille de cuivre dont l’épaisseur de ne doit pas dépasser un micron. L’absorption plus ou moins importante des électrons incidents par les particules de l’échantillon donne naissance à une image électronique, transformée en une image optique contrastée par projection sur un écran fluorescent.
Afin de renforcer les différences de densité électronique au sein de l’échantillon et permettre ainsi une meilleure visualisation de celui-ci, nous avons eu recours à la technique de la coloration négative.
Pour ce faire, une solution aqueuse d’acétate d’uranyle (1% massique dans l’eau), a été utilisée pour caractériser le vecteur de base, les complexes binaires et ternaires. Par ailleurs, nous avons utilisé le tétraoxyde d’osmium afin de déterminer l’agencement des éléments au sein du système. Ce contrastant étant spécifique des doubles liaisons carbone-carbone, permet de repérer l’acide linoléique ou oléique au sein du système.
Le microscope utilisé pour ces analyses est un appareil Jeol® JEM 1011 à 120 Kv. Les échantillons sont déposés sur des grilles de cuivre Formwar® couvertes d’un film de carbone. 1.4.2 Diffusion dynamique de la lumière
La taille et la distribution de taille des objets formés est déterminée par la technique de diffusion dynamique de la lumière. Le principe de cette technique consiste à mesurer les fluctuations de concentrations locales induites par le mouvement brownien des particules en solution. Elle permet d’évaluer le coefficient de diffusion des particules par l’analyse de l’intensité de la lumière diffusée à 173°, ceci permettant de déterminer le rayon hydrodynamique de ces particules supposées sphériques.
Les mesures ont été réalisées sur un appareil Malvern Instruments® Nano ZS ZEN3600, équipé d’un laser He-Ne émettant une lumière monochromatique de longueur d’onde 633 nm. Les limites de détermination de taille de l’appareil sont comprises entre 0,6 nm et 6 µm.
Les échantillons contenant les objets ont été analysés par diffusion dynamique de la lumière sans préparation spécifique préalable.
1.5 Formulation et caractérisation des complexes à base de chitosan
1.5.1 Formulation du vecteur de base : le lactochitosan
Mode opératoire
La préparation du lactochitosan est décrite au niveau de la figure A-1 et comprend les étapes successives suivantes :
Partie expérimentale
200
Le lactochitosan est préparé en solubilisant l’oligomère de chitosan (m=0,120 g / C = 7,13.10-4 mol/L), de faible viscosité, caractérisé par une masse moyenne de 4 kDa et un degré de désacétylation de 85% dans 50 ml d’une solution aqueuse d’acide lactobionique (1,4.10-2 mol/L). La concentration de la solution d’acide lactobionique est ajustée de sorte à ce que le chitosan et l’acide lactobionique se trouvent dans des proportions stœchiométriques.
Figure A-1 : mode opératoire suivi pour la préparation de lactochitosan
La préparation est agitée pendant 12 heures, à 60°C, filtrée à l’aide d’un papier filtre (8-10 µm). L’échantillon obtenu présente un aspect stable et limpide.
1.5.2 Caractérisation physico-chimique
Pour rappel, les structures chimiques du chitosan et de l’acide lactobionique sont présentées sur la figure A-2.
Figure A-2 : structure chimique du chitosan A) et de l’acide lactobionique B)
RMN 1H (D2O, 500 MHz), à 25°C
Les déplacements chimiques caractéristiques du lactochitosan, en RMN1H sont présentés dans le tableau suivant :