P RESENTATION ET CARACTERISATION DES ALLELES UTILISES

2.2.1 P

Afin d’étudier le mode de reconnaissance de ses différents substrats, nous avons décidés d’utiliser quatre allèles distincts de DCL4 (dcl4-3, dcl4-6,

dcl4-8¸et dcl4-70b1) (Figure 2.1A). Les allèles dcl4-3, dcl4-6, dcl4-8 ont été

identifiés au laboratoire au cours d’un crible génétique sur la lignée SUC:SUL, et sont tous incapables de générer les siRNAs de 21 nt provenant de l’IR exogène SUL (Dunoyer et al, 2005, 2007). L’allèle dcl4-70b1 a, quant à lui, été isolé au laboratoire de J. Carrington au cours d’une mutagénèse visant à identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la biogénèse des tasiRNAs jouant un rôle dans la régulation de la morphologie foliaire (TAS3) (Cuperus

et al, 2010).

L’allèle dcl4-3 présente une substitution d’une proline (P) en leucine (L) dans le domaine PAZ. La mutation portée par l’allèle dcl4-6 conduit à la substitution d’une arginine (R) en glutamine (Q) également dans ce domaine. L’allèle mutant dcl4-8 possède une mutation dans le domaine DEAD-Helicase conduisant au changement d’une glycine (G) en acide aspartique (D). Enfin, l’allèle dcl4-70b1 présente une substitution d’une glycine (G) en arginine (R) située entre le domaine PAZ et le premier domaine RNase III (Figure 2.1A). Ainsi, on peut noter qu’à l’exception de dcl4-8, les trois autres allèles portent une mutation dans ou à proximité du domaine PAZ de DCL4. En parallèle, le mutant nul d’insertion T-DNA dcl4-2 a été utilisé comme contrôle négatif (Xie

2.2.2 C

Dans le but de caractériser moléculairement l’impact de ces différentes mutations sur l’accumulation des sRNAs endogènes DCL4-dépendant, les ARN totaux de feuilles de ces mutants ont été extraits et analysés par northern blot à l’aide de sondes spécifiques de sRNAs représentatifs de chacune de ces catégories (Figure 2.1B).

Dans le cas du mutant dcl4-3, seuls les siRNAs provenant de l’IR exogène SUL ne sont pas générés. En effet, des niveaux similaires d’accumulation à ceux d’une plante sauvage sont observés pour les tasiRNAs TAS1 (@255), TAS3 et le miRNA DCL4-dépendant miR822. A l’inverse, le mutant dcl4-8 semble se comporter comme un mutant nul puisqu’aucun des sRNAs DCL4-dépendant ne semble être produit dans ces plantes (Figure 2.1 B; Dunoyer et al, 2007). Le mutant dcl4-6, quant à lui, est toujours compétent pour la biogenèse des tasiRNAs TAS1 (@255) et TAS3, mais n’est plus capable de produire miR822. Enfin le mutant dcl4-70b1, en plus d’être déficient dans la biogénèse des miRNAs DCL4-dépendant (@822), présente la particularité de ne plus être capable de produire les tasiRNAs TAS3 (AGO7-dépendant) mais de rester parfaitement compétent pour la biogénèse des tasiRNAs TAS1 (AGO1-dépendant) (Figure 2.1 B; Cuperus et al, 2010). Ces défauts d’accumulation des tasiRNAs TAS1 et TAS3, observés dans ces différents mutants, ne sont pas liés à un effet indirect de ces mutations sur la biogénèse des miRNAs dont dépendent ces sRNAs pour leur production (miR173-TAS1, miR390-TAS3) (Allen et al, 2005). En parallèle, la mutation

dcl4-70b1 a été introduite dans le système rapporteur SUC:SUL afin de

déterminer l’effet de cette mutation sur la biogénèse des siRNAs DCL4-dépendant provenant d’IR exogène. Comme dans le cas des autres allèles, les plantes SSxdcl4-70b1 ne présentent pas le phénotype caractéristique lié au silencing du gène SUL de cette lignée transgénique. Cette absence de phénotype découle, là aussi, de l’absence des siRNAs de 21 nt provenant de l’IR SUL, indiquant que DCL4-70b1 est également déficient dans la biogénèse de cette catégorie de sRNAs.

chez ces allèles, pourraient être dues à une variation dans l’accumulation de DCL4 ou de son cofacteur, DRB4. En effet, DCL4 pourrait avoir une affinité plus importante pour un ou plusieurs types de substrat donné. Ainsi, lorsqu’elle serait présente en plus faible quantité, cette différence d’affinité pourrait toujours lui permettre de produire efficacement les sRNAs provenant de ces substrats, mais plus ceux découlant de précurseurs pour lesquelles elle aurait une plus faible affinité. De même, la présence de DRB4 est plus ou moins requise pour la production des différents types de sRNAs DCL4-dépendant. Ainsi, l’accumulation des miRNAs DCL4-dépendant semble être plus sensible à l’absence de DRB4 que celle des tasiRNA (Figure 2A, Montavon et al, soumis). Afin d’écarter cette possibilité, les niveaux d’accumulation de DCL4 et de DRB4 dans les plantes exprimant ces différents allèles ont donc été détectés par western blot à partir d’extrait protéique total de fleurs (Figure 2.1C). Aucune diminution des niveaux de DCL4 ou DRB4 n’a pu être observée chez ces mutants (Figure 2.1C), indiquant que le découplage dans la production des différents sRNAs DCL4-dépendant n’est pas dû à une déstabilisation de ces deux protéines.

Ainsi, à l’exception du mutant dcl4-8 dont la mutation dans le domaine DEAD-Helicase semble totalement abolir la capacité de clivage des ARNdb, chacun des autres allèles de DCL4 semblent avoir sa propre spécificité de substrat. De plus, aucune de ces mutations dans, ou à proximité du domaine PAZ, ne semblent affecter l’activité RNase III de DCL4 per se. En effet, bien que les allèles DCL4-3, DCL4-6 et DCL4-70b1 ne soient plus capables de produire certains sRNAs DCL4-dépendant, ceux pour lesquels ils sont toujours compétents s’accumulent à des niveaux identiques à ceux observés dans une plante sauvage (Figure 2.1B). Cette caractérisation moléculaire permet donc d’émettre l’hypothèse que le découplage observé dans la biogénèse de ces différents sRNAs pourrait, soit provenir de la perte d’une interaction entre DCL4 et un cofacteur spécifiquement impliqué dans l’une de ces voies, soit d’un défaut de reconnaissance d’un ou plusieurs types de précurseur par ces mutants.

Figure 2.2: Stratégie expérimentale pour l’étude du mode d’action de DCL4

(A) Des plantes dcl4-2 ont été transformées avec un transgène exprimant sous contrôle de son propre promoteur, une version étiquetée (FHA ou GFP) de la protéine DCL4 sauvage ou mutée (DCL4-3, DCL4-6, DCL4-8, DCL4-70B1). (B) A l’exception des plantes exprimant la protéine DCL4:GFP, deux lignées transgéniques ont été sélectionnées pour chaque construction et l’expression des protéines étiquetées a été analysée par western blot. Loading : La coloration au bleu de coomassie des protéines sert ici de témoin de charge.