E TUDE DE LA FIXATION DES PRECURSSEURS DE S RNA

DCL4-

DCL4-6

DCL4-8

En vue de déterminer si l’absence de production de certains sRNAs DCL4-dépendant, observée dans notre série allélique de DCL4, provenait d’un défaut de reconnaissance de leur précurseur par ces mutants, nous avons réalisé des expériences de “RNA immunoprecipitation” (RIP) à partir de nos plantes transgéniques exprimant les protéines DCL4-6:FHA ou DCL4-8:FHA. Le choix de ces deux allèles s’est fait d’une part car ceux sont les mutants les plus fortement affectés dans la diversité des sRNA DCL4-dépendant produits, et d’autre part car ils portent leur mutation au niveau de deux domaines distincts (DEAD-Helicase pour DCL4-8, et PAZ pour DCL4-6). Après immunoprécipiation, les ARN associés à ces deux protéines ont été extraits et analysés, soit par northern blot à l’aide de sondes spécifiques des sRNAs DCL4-dépendant (DCL4-8), soit par séquençage à haut débit (RIP-seq; DCL4-6 et DCL4-8). En parallèle, des plantes sauvages Col-0, servant de contrôle négatif, ont été traitées de façon similaire.

Après vérification par western blot de l’efficacité d’immunoprécipitation de ces deux protéines étiquetées (Figure 2.7A et 2.7B), l’analyse par northern blot des acides nucléiques associés à DCL4-8 a permis de mettre en évidence la présence d’ARN de haut poids moléculaire sur ces membranes (Figure 2.8). En effet, un signal correspondant aux précurseurs du miRNA DCL4-dépendant (@miR822) et des tasiRNA TAS1 et TAS3 (@255, @TAS3) a pu être détecté spécifiquement dans la fraction IP obtenue avec la protéine DCL4-8:FHA et n’a jamais pu être observé dans notre contrôle négatif (Figure 2.8). De même, aucun signal correspondant aux miRNAs DCL1-dépendant (@156, @159) ou au contrôle de charge (@snRNA U6) n’a pu être mis en évidence dans la fraction immunoprécipitée par DCL4-8. Ainsi, la corrélation observée entre la détection spécifique d’ARN de haut poids moléculaire en association avec cette protéine, et l’absence de production par celle-ci des sRNAs DCL4-dépendant découlant de ces précurseurs, indiquent que les défauts de biogénèse de ces sRNAs ne

Figure 2.8: Etude de la fixation des différents précurseurs de sRNAs DCL4-dépendant par DCL4-8

Les ARN associés à la protéine DCL4-8 immunoprécipitée (RIP, cf. figure 2.7A) ont été analysés par northern blot à l’aide de sondes spécifiques des tasiRNAs (@255, @TAS3), du miRNA DCL4-dépendant miR822 (@822) et des miRNAs DCL1-dépendant miR156 et miR159 (@156, @159). Les flèches indiquent l’apparition de bande de haut poids moléculaire correspondant aux précurseurs des sARNs analysés. Le snRNA U6 (@U6) est utilisé comme contrôle de charge pour la fraction totale.

D’autre part, ces résultats valident, au moins pour DCL4-8, l’utilisation de cette approche pour les expériences de RIP-seq.

A ce stade, il est intéressant de noter qu’au cours des analyses par northern blot de notre série allélique de dcl4 (Figure 2.9A), et des lignées transgéniques exprimant ces protéines mutantes (Figure 2.9B), nous avons également pu observer la stabilisation d’ARN de haut poids moléculaire dans les fractions “ARN total”. En effet, en présence de DCL4-8, un signal de haut poids moléculaire est détecté avec les sondes révélant les sRNAs TAS1, et miR822, alors que seule cette dernière donne un signal en présence de DCL4-6 et DCL4-70b1. A l’inverse, aucun signal n’est détecté à ce niveau pour TAS1 et miR822 dans les plantes sauvages Col-0 ou les lignées transgéniques exprimant les versions étiquetées de DCL4 sauvage ou DCL4-3. Aucune visualisation ne peut malheureusement être faite avec la sonde révélant les tasiRNAs TAS3, car le bruit de fond généré par cette sonde masque totalement la détection d’un signal spécifique de haut poids moléculaire dans les fractions “ARN total”. Malgré cela, la détection de ces ARN de grande taille, spécifiquement dans les mutants affectés pour la production des sRNAs correspondants, suggère fortement que ce signal découle de la stabilisation de leurs précurseurs, comme mis en évidence lors des expériences de RIP présentées ci-dessus (Figure 2.8). Le corollaire de ces observations est que DCL4-6 (et DCL4-70b1), tout comme DCL4-8, doit vraisemblablement être capable de se fixer aux précurseurs dont elle n’est plus capable de générer les sRNAs correspondants, et ainsi de les stabiliser. En accord avec cette hypothèse, il est intéressant de noter qu’aucun signal correspondant à ces précurseurs n’est détecté dans le mutant dcl4-2. Ceci s’explique probablement par le fait qu’en l’absence de protéine DCL4, ces précurseurs sont pris en charge et cliver par la protéine DCL2. A l’inverse, en présence d’une protéine DCL4 non fonctionnelle, mais toujours capable de se fixer à ses précurseurs, DCL2 ne peut remplir son rôle de substitution à DCL4.

Figure 2.9: Stabilisation des précurseurs des sRNAs DCL4-dépendant.

Analyses de l’accumulation du tasiRNA (@255) et du miRNA DCL4-dépendant (@822) dans les plantes présentées en figure 2.1B (gauche) et figure 2.3 (FHA) (droite). Les flèches indiquent l’apparition de bande de haut poids moléculaire correspondant aux précurseurs des sARNs analysés dans la fraction ARN total. Le miRNA DCL1-dépendant miR159 (@159) et le snRNA U6 (@U6) sont utilisé ici comme contrôle de charge.

(Figure 2.7B et Figure 2.10). Pour cela, les protéines 6:FHA et DCL4-8:FHA ont été immunoprécipitées à partir de plantules ou de fleurs, et les ARN associés à ces protéines ont été séquencés à haut débit (RIP-seq). Dans un premier temps, l’analyse bioinformatique des librairies ainsi obtenues s’est focalisée sur les cibles connues de DCL4. Cette analyse a permis de révéler que les précurseurs des tasiRNAs (TAS1, TAS2, TAS3), de divers miRNAs DCL4-dépendant (dont miR822 et miR839; Rajagopalan et al, 2006), ainsi que ceux d’endoIR-siRNAs (notamment IR71, IR2039 et IR-AtGP10; Montavon et al, soumis), sont spécifiquement détectés dans les IP de DCL4-6 et DCL4-8, mais jamais ou très faiblement dans le contrôle négatif (Figure 2.10). Ces résultats sont en adéquation avec le rôle de DCL4 dans la biogénèse de l’ensemble de ces sRNAs. De manière intéressante, si les niveaux de précurseurs de miRNAs DCL4-dépendant observés dans ces librairies sont similaires entre ces deux allèles mutants, la quantité de précurseurs correspondant aux divers tasiRNAs est, quant à elle, fortement enrichie dans les librairies DCL4-8 (Figure 2.10B). Cet enrichissement coïncide avec l’incapacité de DCL4-8 à générer les tasiRNAs, là où DCL4-6 demeure compétent pour leur production. A l’inverse, les niveaux similaires de miRNAs DCL4-dépendant entre ces deux allèles illustrent l’incapacité de ces deux protéines à générer ce type de sRNAs. Ces résultats suggèrent fortement (i) que la stabilisation des précurseurs des divers sRNAs DCL4-dépendant observée par northen blot (Figure 2.8 et Figure 2.9) provient de leur fixation par des mutants de DCL4 ayant perdu la capacité de les cliver spécifiquement et (ii) que le découplage des différents allèles dans la biogénèse des sRNAs DCL4-dépendant ne vient pas d’un défaut de fixation à leurs précurseurs.

Figure 2.10: Identification des précurseurs de sRNAs associés à DCL4-6 ou DCL4-8

(A) Tableaux résumant les ARN spécifiquement associés ou fortement enrichis dans les fractions immunoprécipitées de DCL4-6 ou DCL4-8. Ces ARN sont triés en fonction des différentes classes de sRNAs qu’ils génèrent (tasiRNA; gauche, miRNA; milieu, endoIR-siRNA; droite). Ces tableaux constituent des listes non exhaustives des différents ARN identifiés à partir de fleurs. (B) Représentation schématique des séquences obtenues au cours des expériences de RIP-seq sur les protéines DCL4-6:FHA ou DCL4-8:FHA, au niveau de loci représentatifs des trois classes de sRNAs endogènes DCL4-dépendant (MIR822 haut gauche, TAS2 haut droit, IR71 bas).