P REPARATION DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES POUR ANALYSES CHIMIQUES

Les analyses chimiques, utilisées en complément des essais biologiques et de biologie moléculaire (essai comètes), ont pour objectif de mettre en évidence le potentiel de bioaccumulation des substances étudiées dans les tissus de Eisenia andrei. Les échantillons à analyser sont des matrices biologiques complexes, qu’il faut d’abord extraire et purifier avant toute analyse instrumentale.

2.3.2.1 Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe (QuEChERS)

La méthode de préparation d’échantillon appelée QuEChERS existe depuis 2003. Initialement conçue pour l’analyse des pesticides dans les végétaux (fruits et légumes destinés à la consommation humaine notamment), elle est maintenant adaptée à de très nombreuses molécules dans diverses matrices solides (57). Les méthodes dérivées des QuEChERS sont particulièrement intéressantes pour les analyses multi-résidus et/ou lorsque le nombre d’échantillons à traiter est important. C’est pourquoi elle est utilisée pour analyser les pesticides et produits pharmaceutiques dans des matrices environnementales, comme les boues de station d’épuration (58, 59), les sols (60) ainsi que les vers de terre (61).

25 préparé convenablement, idéalement réduit en poudre ou broyé afin de maximiser l’efficacité de l’extraction par le solvant. Le choix du solvant dépend de la nature des analytes. Après extraction, l’ajout d’une grande quantité de sel (NaCl et un sel asséchant comme MgSO4) génère un effet de relargage (salt-out) : en saturant la phase aqueuse, la solubilité des molécules organiques dans cette phase est fortement réduite, augmentant par la même le recouvrement de ces molécules dans la phase organique. L’effet de relargage permet également la séparation de la phase organique et de la phase aqueuse, si le solvant organique choisi est miscible dans l’eau. L’ajustement du pH des solvants est souvent nécessaire, via l’utilisation de tampons (acétate, citrate) ou simplement d’acides. La séparation est complétée par une centrifugation qui fait également précipiter les sels. La phase organique est récupérée et mise à évaporer sous un flux d’azote, en chauffant légèrement (< 40 °C). Cette évaporation permet de concentrer l’extrait ou de le sécher complètement afin de le reconstituer dans un autre solvant organique, s’il est plus approprié pour l’étape de purification. Celle-ci est faite par dSPE (« dispersive Solid-Phase Extraction »). Le principe est de mettre en suspension des phases adsorbantes, plus couramment utilisées sous forme de cartouche pour la purification d’extrait liquide. Elles vont adsorber les impuretés et donc purifier l’extrait. Ces phases sont généralement constituées par de la silice greffée C18 ou amines (PSA), mais il est possible d’y associer d’autres solides comme du carbone graphite (62, 63). Une petite quantité de MgSO4 ou autre sel déshydratant est ajoutée pour éliminer les traces d’eau résiduelle. Par centrifugation, les sels sont précipités et il est possible de récupérer la phase organique. Celle-ci est de nouveau évaporée puis reconstituée dans le solvant qui servira pour les analyses instrumentales. Lors du changement de solvant, certaines impuretés restantes peuvent précipiter, il est généralement plus prudent de filtrer les extraits sur un filtre adapté aux solvants organiques avant les analyses.

Pour résumer, une QuEChERS est une extraction par le solvant assistée par un effet de relargage, suivie d’une purification par dSPE et d’une filtration avant analyse. Réduisant grandement le temps de préparation des échantillons, cette méthode est adaptable à différentes matrices et différents CO.

2.3.2.2 Préparation d’échantillons pour analyses des pesticides et PPs

Une méthode précédemment publiée par le laboratoire a servi de base pour la mise en place d’une méthode répondant au mieux aux besoins des études présentées dans ce mémoire (64).

26 Puisque l’analyse des pesticides et des PPs est un outil complémentaire pour évaluer les effets des CO sur les vers de terre, elle doit être particulièrement efficace pour les analyses des CO dans les vers. C’est pourquoi les optimisations de la méthode ont été faites pour les extractions des CO d’intérêt des vers de terre.

La méthode initiale a été mise en place pour les mêmes molécules que celles qui nous intéressent ici. La première phase d’optimisation a été réalisée dans le solvant uniquement, c’est pourquoi les efforts d’optimisation ici ont portés sur la réduction des effets de matrices dans l’échantillon initial et ce en testant plusieurs phases adsorbantes et conditions de pH. Pour réduire le nombre d’essais au minimum et faciliter le traitement des données, tant pour des questions de coût et de temps que pour réduire le nombre de vers de terre sacrifiés pour cet objectif, des plans

Figure 7 : Procédure d’extraction des sols et des vers de terre : à gauche (en bleu) pour les

27 d’expériences factoriels complets à 2k _{facteurs ont été mis en place ici. Le détail de la procédure} et les paramètres retenus après optimisation sont présentés Figure 7.

Les vers de terre sont broyés encore gelés avant l’extraction à l’aide d’un mortier et d’un pilon en ambre, d’où l’étape supplémentaire de rinçage de mortier avant la suite de l’extraction. Pour les sols échantillonnés aux 28ème _{et 56}ème _{jours des tests de reproduction, ce sont des échantillons} de 2 g de sol qui sont extraits suivant la même procédure. Le taux de récupération n’est pas significativement affecté par cette augmentation de masse d’échantillon.

2.3.2.3 Préparation d’échantillons pour analyse des PCPs

Les PCPs faisant l’objet de notre étude, à savoir le triclosan, triclocarban et méthyl-triclosan, sont désormais connus pour être omniprésents dans les boues de station d’épuration provenant de plusieurs régions du monde (13, 39, 65–67). Parmi les produits de dégradation du TCS précédemment caractérisés, le méthyl-triclosan a été le seul retrouvé dans les boues de station d’épuration (68), et le seul déterminé comme formé par biométhylation dans les sols (66). C’est pourquoi nous avons choisi de nous focaliser sur le TCS et ce produit de dégradation, en incluant le TCC dans notre méthode. Ceci est relativement aisé compte tenu de la proximité structurale entre les deux composés parents.

Le développement de la méthode a été fait sur du sol, puis les taux de récupération dans les boues ont été vérifiés, afin de déterminer la teneur moyenne des boues de la région de Sherbrooke en TCS et TCC. Une estimation du facteur de dilution des boues lors d’un épandage classique en champ agricole a permis d’obtenir une concentration réaliste pour l’exposition des vers dans le cadre du test de reproduction en sol artificiellement contaminé. Les performances de la méthode d’extraction ont été par la suite étudiées dans les sols et les vers de terre.

Les paramètres retenus sont présentés Figure 7. Pour l’analyse des boues, l’échantillon doit être dilué 10 fois avant analyse par Chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à un spectromètre de masse en tandem (UHPLC-MS/MS) à cause des hautes teneurs à quantifier. Bien qu’ajoutant une étape supplémentaire à la procédure, cette dilution a le grand avantage de diluer la matrice et par conséquent d’augmenter la sensibilité de la méthode en réduisant les possibles effets de matrice.

28 quantifier, la méthode mise en œuvre doit être compatible avec la méthode d’analyse instrumentale appliquée par la suite.