A biomassa de E. globulus foi caracterizada antes e após a hidrólise enzimática. Antes da hidrólise enzimática, ambas biomassas in natura e pré-tratada por explosão a vapor foram caracterizadas quanto ao teor de cinzas, proteínas, carboidratos estruturais e lignina insolúvel em ácido. A quantidade de extraíveis foi determinada somente para a biomassa pré-tratada. Após a hidrólise enzimática, o material foi caracterizado por alterações nos carboidratos e na lignina.
• Extraíveis. A quantificação dos extraíveis presentes na biomassa de E. gobulus foi realizada de acordo com a metodologia do Laboratório Nacional de Energias Renováveis (NREL-TP-510-42619), com modificações. Dois gramas de E. globulus in natura foram submetidos a um processo de extração em aparelho Tecnal TE-044-8/50, utilizando como solvente 95% de etanol (~ 100 °C, por 8 h), seguido de extração com água quente (~ 100 ºC, por 8 h). Após extração, o solvente foi recuperado e o resíduo foi seco num frasco de vidro. Por diferença de massa, a porcentagem do extrato foi obtida em relação à massa seca do material originalmente utilizado no ensaio.
• Cinzas. A determinação de cinzas foi realizada por gravimetria, de acordo com a metodologia NREL-TP-510-42621, com modificações. Uma quantidade igual a 300 mg de biomassa de E. globulus foi calcinada em estufa a 550 °C por 4 h.
• Proteínas. O teor de proteínas foi determinada com 200 mg de E. globulus seco, tanto
in natura quanto pré-tratado, pela quantificação do nitrogênio total pelo método de Dumas
(1826) e Buckee (1994). A amostra foi incinerada a uma temperatura de cerca de 1000 °C. Para a análise, foi utilizado um analisador LECO TruMac (Leco Instruments). Para determinar a quantidade de proteína nas amostras de E. globulus, utilizou-se um fator de conversão proteico igual a 6,25.
• Carboidratos e lignina. A composição química de E. globulus in natura e pré-tratado foi realizado de acordo com a metodologia NREL-TP-510-42618, por lignina Klason. Uma quantidade igual a 300 mg de amostra foi tratada com 3 mL de H2SO4 72% (v/v) a 30 ºC por 1 h. A mistura foi então diluída com água para uma concentração de H2SO4 final igual a 4% (v/v) e suspensão autoclavada a 121 ºC por 1 h para promover a hidrólise total de oligossacarídeos e polissacarídeos. Subsequentemente, a mistura foi filtrada através de cadinho de Gooch, porosidade 2 (30 mL). O resíduo sólido foi lavado com água morna e colocado para secar em estufa a temperatura constante e a porcentagem de lignina insolúvel em ácido foi determinada em relação à massa da amostra seca. O filtrado foi coletado, filtrado novamente através de uma membrana de nylon de 20 µm e submetido à HPLC.
3.22 Grafting enzimático
3.22.1 Remoção de extraíveis da madeira
As chapas de madeira de E. globulus para os ensaios de grafting enzimático foram fornecidas pela empresa galega FINSA (Financiera Maderera AS, Galícia, Espanha). As chapas foram cortadas em pedaços de 2 cm × 5 cm com 0,5 mm de espessura e submetida a extração com solvente em extrator Soxhlet (Afora, extrato de 50 mL, refrigerador Dimroth, balão de 100 mL) por 8 h, utilizando acetona, conforme metodologia descrita no TAPPI-280. Em seguida, realizou-se uma segunda extração com água a 100 ºC por 1 h. Na sequência, as chapas de madeira foram secos em estufa a 50 °C overnight e, posteriormente, pesadas. A massa média das chapas de madeira após a extração foi de 0,296 ± 0,006 g.
3.22.2 Ensaios de consumo de oxigênio
O consumo de oxigênio foi medido para acompanhar a oxidação dos diferentes substratos e mediadores. Nesses ensaios, três substratos foram utilizados para verificar o potencial de oxidação das lacases de M. palmivorus VE111: octil galato (octil 3,4,5-tri- hidrobenzoato), lauril galato (dodecil 3,4,5-tri-hidrobenzoato) e octilamina (1-octilamina). Adicionalmene, dois compostos fenólicos foram usados como mediadores: catecol (benzeno- 1,2-diol) e guaiacol (2-metoxifenol). Um ensaio controle de lacase em contato com a chapa de madeira de eucalipto foi realizado.
O consumo de oxigênio foi medido em oxímetro Accumet 600XL (Fisher Scientific), associado a uma sonda de oxigênio (Fisher Scientific, 13-620-SSP) e software de aquisição de dados em tempo real (AccumetComm). O teste de consumo de oxigênio foi realizado em tubos Falcon de 50 mL, a 40 ºC, com uma mistura líquida composta por citrato de sódio (0,05 mol/L, pH 4,0), 30% de etanol, 5 mmol/L de substrato e/ou 1 mmol/L de mediador e 100 U de lacase de M. palmivorus VE111.
3.22.3 Hidrofobização da madeira de E. globulus por tratamento enzimático
A hidrofobização da madeira de E. globulus por meio de tratamento enzimático seguiu a metodologia proposta por Fernández-Fernández et al. (2015), com modificações. As chapas de madeira foram imersos em cristalizadores de vidro com a mistura líquida descrita na seção 3.22.2. Os substratos e mediadores foram os mesmos descritos na seção anterior. Diferentes doses de lacase por grama de madeira foram utilizadas (20 U/g, 50 U/g e 100 U/g). Quatro diferentes condições controle foram estabelecidas: controle 1 (somente tampão, sem substrato, mediador ou enzima), controle 2 (tampão e enzima, sem adição de substrato ou mediador), controle 3 (tampão e substrato, sem adição de enzima ou mediador) e controle 4 (tampão, substrato e mediador, sem adição de enzima). O volume total da reação foi de 50 mL. A reação foi incubada a 40 ºC, durante 2 h, num agitador orbital a 75 rpm. Após tratamento enzimático, os pedaços de madeira foram lavados como descrito na secção 3.22.1 e secos à temperatura ambiente overnight. A etapa de lavagem foi realizada para remover o octil galato, o lauril galato e a octilamina que não estavam estavelmente ligados à madeira.
3.22.4 Ângulo de contato da água
A hidrofobicidade das chapas de eucalipto após o tratamento enzimático foi avaliada conforme Filgueira et al. (2017), medindo-se o ângulo de contato da água na madeira com o auxílio de um goniômetro MobileDrop GH11 (KRÜSS) durante 2 min após o depósito de uma gota de água destilada. A forma da gota foi analisada usando o software DSA2 (KRÜSS).
3.22.5 Absorção de água
Após a medição do ângulo de contato com a água, as amostras foram completamente secas overnight a 50 ºC em estufa. Para calcular a absorção de água pelas chapas de eucalipto, as amostras secas foram imersas em 50 mL de água destilada em um tubo Falcon (Filgueira et
al., 2017). O peso das chapas de eucalipto foi calculado antes da imersão e a cada 30 min até 3
h de imersão, a cada 1 h até 8 h e, finalmente, após 24 h de imersão. A absorção de água pelas chapas de eucalipto (em % de peso) foi calculada como a porcentagem da massa seca inicial seguindo a Equação:
Absorção de água (%) = (Wi – W0 / W0) x 100 Equação 11
onde W0 refere-se à massa inicial das chapas secas de eucalipto e Wi à massa das chapas de
eucalipto após imersão em água.