A biomassa micelial para o cultivos com M. palmivorus VE111 foi determinada através da massa seca fúngica, de acordo com o método de Rapp et al. (1981). Nos ensaios em frascos, 100 mL da cultura foi centrifugado por 9600 × g por 20 minutos, após a retirada do
sobrenadante, a biomassa foi lavada três vezes com água destilada (10 mL) e após mantida em estufa a 90 °C, até massa constante. Nos ensaios em biorreator, alíquotas de 15 mL foram centrifugadas, sendo a massa micelial empregada para determinação de crescimento fúngico.
3.6 Determinações enzimáticas
Todas as atividades enzimáticas foram expressas em unidades internacionais por mL (U/mL), definidas como a quantidade de enzima que libera um µmol do produto por mL, por minuto (U = µmol/min).
3.5.1 Lacases
A atividade de lacases foi determinada segundo Wolfenden & Wilson (1982), através da quantificação do produto da oxidação do 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), (ABTS) 5 mmol/L, utilizado como substrato. A mistura reacional (0,4 mL) era composta por 0,18 mL de tampão acetato de sódio 0,2 mol/L, pH 5,0; 0,18 mL de extrato enzimático e 0,04 mL do substrato ABTS 5 mmol/L. A oxidação do ABTS foi monitorada em espectrofotômetro (420 nm) durante 90 s, a 25°C.
3.5.2 Peroxidases totais
As peroxidases totais foram dosadas empregando-se a mesma metodologia de determinação de lacase, utilizando ABTS como substrato, entretanto com a presença de 0,04 mL de H2O2 2 mmol/L e somente 0,14 mL de tampão acetato de sódio 0,2 mol/L, pH 5,0, na mistura reacional (Heinzkill et al., 1998). As atividades de peroxidases foram descontadas das atividades detectadas para lacases.
3.5.3 Manganês peroxidases
A atividade de manganês peroxidases foi determinada pelo método proposto por Kuwahara et al. (1984), utilizando-se o vermelho de fenol como substrato. A mistura reacional (2 mL) era composta por 1 mL de tampão succinato de sódio 20 mmol/L, pH 4,5; 0,1 mL de vermelho de fenol 0,1 % (m/v); 0,1 mL de lactato de sódio 250 mmol/L; 0,2 mL de albumina bovina 0,5% (m/v); 0,05 mL de MnSO4 2 mmol/L; 0,05 mL de H2O2 2 mmol/L, sendo adicionados 0,5 mL de amostra. Após 5 min a 30°C, as reações foram interrompidas pela adição de 0,04 mL de NaOH 2 mol/L. A formação do produto de oxidação foi quantificada pela variação da absorbância em espectrofotômetro (610 nm).
3.5.4 Lignina peroxidases
A atividade de lignina peroxidases foi determinada pela formação de veratrilaldeído, em uma mistura reacional contendo 0,1 mL de álcool veratrílico 4 mmol/L; 0,1 mL de H2O2 2 mmol/L; e 0,2 mL de amostra em meio tamponado com 250 mmol/L de tartarato de sódio pH 3,0 sendo o volume final de 0,4 mL (Tien & Kirk, 1984). A variação de absorbância foi observada em espectrofotômetro (310 nm), durante 5 min, a 30 ºC.
3.5.5 Oxidases do álcool veratrílico
A atividade das oxidases do álcool veratrílico foi determinada pela formação de veratrilaldeído a partir de uma reação contendo: 0,2 mL de álcool veratrílico 2 mmol/L e 0,2 mL de amostra em meio tamponado com 250 mmol/L de tartarato de sódio pH 5,0, com volume final de 0,4 mL, sendo a reação monitorada em espectrofotômetro (310 nm) durante 5 min, a 30 ºC (Bourbonnais & Paice, 1988).
3.5.6 Atividade sobre papel filtro (FPA)
Para a dosagem de celulases totais foi utilizada a análise de atividade enzimática sobre papel filtro (FPA), de acordo com Camassola & Dillon (2012). Foram utilizadas placas de polipropileno de 96 poços (com volume individual de 1,5 mL). Em cada poço da placa, foi adicionado 10 µL de solução enzimática ou diluição apropriada e 140 µL de tampão citrato de sódio 0,05 mol/L pH 4,8. A placa foi colocada em banho a 50 ºC, durante 10 min, com a finalidade de elevar a temperatura do meio contendo a enzima e o tampão citrato de sódio até a temperatura ideal de hidrólise dessa enzima. Em seguida foram adicionados a cada poço 5 mg de papel filtro (Whatman nº 1) em tiras de 1 cm x 0,6 cm, mantendo-os por 60 min em banho a 50 ºC. Logo após, a reação foi interrompida com a adição de 300 µL da solução do reagente ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959) e a placa foi colocada em banho a 100 ºC, por 5 min. Após resfriamento em temperatura ambiente, foram adicionados 100 µL de amostra em placa de poliestireno cristal de 96 poços (com volume individual de 0,4 mL) e adicionado 200 µL de água destilada sendo a absorbância medida em espectrofotômetro a 545 nm. A determinação das atividades sobre papel filtro presentes nas amostras foram determinadas através de curva de calibração construída com soluções de glicose, por meio de regressão linear.
3.5.7 Endoglicanases
A determinação da atividade de endoglicanases, segundo Ghose (1987) com modificações, foi realizada empregando-se 1 µL da solução enzimática ou diluição apropriada e 49 µL de tampão citrato de sódio 0,05 mol/L pH 4,8 em cada poço da placa de 96 poços. A placa foi colocada em banho a 50 ºC, por 10 min. Em seguida, foram adicionados a cada poço 50 µL de solução de carboximetilcelulose 2% (m/v), previamente aquecida a 50 °C, mantendo as placas por 30 min em banho a 50 °C. Após, a reação foi interrompida com a adição de 300 µL da solução do reagente DNS e a placa foi colocada em banho a 100 ºC, por 5 min. A leitura, em espectrofotômetro, e a determinação da atividade de endoglicanases procederam tal como para FPA.
3.5.8 β-glicosidases
Para a determinação da atividade de β-glicosidases foi utilizado ρ-nitrofenil-β-D- glicopiranosídeo (ρNPG), segundo a metodologia adaptada de Daroit et al. (2008). Uma mistura reacional (100 μL) contendo 5 μL de água destilada, 5 μL de solução enzimática e 90 μL de ρ- nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (ρNPG 4 mmol/L) foi incubada a 50 ºC por 30 min, sendo interrompida com a adição de 200 μL de uma solução 10% (m/v) de carbonato de sódio (Na2CO3). A leitura das amostras foi estimada espectrofotometricamente por leitura da absorbância de ρNPG a 405 nm e a determinação da atividade foi determinada através de curva de calibração construída com soluções de ρ-nitrofenol (ρNP), por meio de regressão linear.
3.5.9 Xilanases
A determinação das atividades de xilanases foi realizada segundo Bailey et al. (1992). Em cada poço da placa de 96 poços foram adicionados 10 µL de caldo enzimático e 90 µL de uma solução de xilana 1% (m/v) previamente aquecida a 50°C. A placa foi mantida em banho a 50 °C por 5 min. A reação foi interrompida adicionando-se 300 µL de DNS e a placa foi mantida em banho a 100 °C por 5 min. Após resfriamento em temperatura ambiente foram adicionados 100 µL de amostra em placa de 96 poços e adicionado 200 µL de água destilada e a absorbância foi medida em espectrofotômetro a 545 nm. As concentrações de xilanases presentes nas amostras foram determinadas através de curva de calibração construída com soluções de xilose 0,01 mol/L, por meio de regressão linear, utilizando o programa Microsoft Office Excel 2007.