Optimisation de la détection cellulaire

La caractérisation de la couche cellulaire a montré que les monocytes sont bien piégés sur l’électrode. Cependant, le taux d’accroche estimé étant faible, il est nécessaire d’optimiser leur détection et/ou le taux de piégeage. Afin d’augmenter les variations d’impédance enregistrées et donc la sensibilité du capteur, plusieurs paramètres ont été testés comme la conductivité du milieu et la surface des électrodes.

II.2.1. Influence de la conductivité

Il semblerait d’après les travaux Yang et al.24 que plus la conductivité de la solution est faible et plus il est possible d’accéder aux échanges électrochimiques des cellules avec la solution. Des mesures d’impédance électrochimique ont alors été réalisées dans une solution de conductivité très faible, l’eau milliQ de conductivité de 8,55 µS/cm. Les diagrammes de Nyquist enregistrés font apparaitre pour toutes les couches de modification, y compris la couche cellulaire, un demi-cercle contenant une boucle suivie d’une droite (Figure 24).

0 20000 40000 60000 80000 100000120000140000160000180000200000 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 200000 0.1 Hz 0.2 Hz 0.25 Hz 0.5 Hz 1 Hz 2.5 kHz Or nu Thiols Thiols estérifiés PG BSA Ac CD 14 Monocytes - Z im Zr 50 kHz

Figure 24 : Diagrammes de Nyquist réalisés dans une solution d’eau MilliQ pour une électrode d’or nu (1 cm²) ( ) ; recouverte de SAMs mixtes ( ) ; après activation des SAMs ( ) ; après immobilisation de la PG ( ) ; puis saturation de l’électrode modifiée par la BSA ( ) ; après greffage des anticorps ( ) ; et après piégeage des monocytes sains ( ).

La présence de la boucle sur la courbe d’impédance traduit la présence d’une inductance dans le CEE. Cette boucle également présente pour l’or nu pourrait s’expliquer par une absorption compétitive d’espèces mobiles et chargées de l’oxygène sur l’électrode, ce qui entraine des interférences entre l’électrode de référence et l’électrode de travail25. En effet, lors de la polarisation de l’électrode, la faible conductivité de l’électrolyte entraine un gradient de concentration des espèces oxygénées et une fuite d’électrons vers l’électrode de référence.

Ainsi, la diminution de la conductivité de la solution de mesure ajoute un paramètre électrique qui parasite le signal et ne permet pas d’améliorer la détection des cellules. Les mesures ont par conséquent toutes été réalisées dans une solution de PBS, de conductivité proche du milieu osmotique des cellules.

II.2.2. Influence de la taille des électrodes

L’influence de la surface des électrodes a ensuite été étudiée grâce à la caractérisation électrochimique en mode non faradique d’électrodes de surfaces différentes : 1 cm², 0,5 cm² et 0,04 cm². Les diagrammes de Nyquist et de Bode obtenus pour chaque surface sont présentés dans le Tableau 9.

Comme nous pouvons le constater, les diagrammes correspondants aux couches de fonctionnalisation sont les mêmes quelle que soit la surface. En revanche, les diagrammes correspondants à la couche cellulaire montrent une forte augmentation de la variation d’impédance avec la diminution de la surface des électrodes. Cette augmentation s’explique entre autres par l’augmentation de la densité de recouvrement de la couche cellulaire avec la miniaturisation des électrodes. La sensibilité de détection des cellules est ainsi augmentée.

Comme le montre les diagrammes de Bode, il n’y a pas de variation du module de l’impédance pour les fréquences supérieures à 10 kHz. Ces résultats suggèrent qu’à hautes fréquences, l’impédance est dominée par la capacitance diélectrique de la solution de mesure et que la contribution des couches de la fonctionnalisation et des monocytes est minimale. Entre 1 kHz et 10 kHz, l’impédance est la combinaison de la capacité de la solution et de l’impédance des couches de modification et des cellules. Enfin, la variation de l’impédance essentiellement due aux monocytes apparait à des fréquences inférieures à 100 Hz 26.

Tableau 9 : Récapitulatif des courbes de nyquist et des diagrammes de bode réalisés dans une solution de PBS à pH = 7,4 pour chaque étape du procédé de fonctionnalisation et après le piégeage cellulaire sur différentes surfaces d’électrodes

Une analyse rapide des courbes a été réalisée en calculant la variation relative de l’impédance due au piégeage des cellules à partir du diagramme de Bode à une fréquence de 200 mHz à l’aide de la relation suivante :

| ( ) ( )| ( )

avec Z(0) le module de l’impédance de l’électrode modifiée par des anticorps avant le piégeage des monocytes et Z(i) le module de l’impédance après le piégeage cellulaire.

Les pourcentages de variations obtenus suite à l’incubation des électrodes dans une suspension cellulaire de 1 million de cellules/mL sont récapitulés sur la Figure 25 pour chaque surface d’électrode étudiée.

Figure 25 : Pourcentage de variation de l’impédance due au piégeage des monocytes sur différentes surfaces d’électrodes après incubation dans une suspension cellulaire de 1 million de cellules/mL.

Comme attendu, le pourcentage de variation de l’impédance augmente avec la diminution de la surface de l’électrode. Ces valeurs ont été obtenues de manière reproductible pour une concentration de 1 million de cellules par mL et ont alors été utilisées comme indicateur pour caractériser le piégeage des monocytes.

Cependant, la réduction de la taille des électrodes pourrait aussi réduire le ratio signal/bruit et ainsi diminuer les performances du capteur. McAdams et al.27 ont montré que les électrodes ont, en plus du bruit thermique, un spectre de bruit de fonction 1/fα, avec α = 2n, n étant le coefficient de la capacité imparfaite. Le bruit thermique, aussi appelé bruit de Nyquist ou de Johnson, provient des mouvements thermiques aléatoires des charges dans les matériaux conducteurs.

immunocapteur pour la détection cellulaire La densité spectrale de puissance du bruit thermique peut être évaluée à l’équilibre thermodynamique par l’équation suivante :

avec kB constante de Boltzmann, T température absolue, Zr impédance réelle.

L’estimation du bruit pour chaque surface d’électrode a été calculée pour l’or nu et pour la couche cellulaire à 200 mHz (Tableau 10).

Tableau 10 : Estimation du bruit suivant la surface de l’électrode pour une électrode d’or nu et une recouverte de cellules Or nu Couche cellulaire ⁄ () DSPth _⁄ () DSPth 1 cm² 17 (1.76) 6.22E-17 12 (1.57) 3.08E-16 0.5 cm² 16.7 (1.75) 8.09E-17 12.7 (1.58) 2.05E-17 0.04 cm² 20.3 (1.87) 7.77E-16 15.4 (1.70) 2.9E-15

Le bruit thermique calculé est très faible et les fonctions partielles des spectres de bruit de coefficient ⁄ sont proches quelle que soit la surface de l’électrode.

L’étude des conditions de mesures d’impédance a ainsi permis d’améliorer la sensibilité de détection du piégeage cellulaire grâce à la diminution de la surface des électrodes sans augmenter le bruit.

II.3. Caractérisation des performances de l’immunocapteur