2.2.1. Temps optimum d’incubation
La souche d’Actinomycète Cpt29 est ensemencée stérilement sur milieu FBM liquide et incubée à 45°C sous agitation (180rpm), pendant plusieurs temps sur une durée de 11 jours. Au bout de chaque jour (24h) des prélèvements sont effectués dans des conditions stériles et après centrifugation à 10000×g pendant 20min, les surnageants sont utilisés comme solution
enzymatique et l’activité kératinolytique est détectée.
2.2.2. pH optimum de culture
Le pH optimum pour la culture de la souche Cpt29 a été étudié en variant le pH du milieu de culture d’une unité de 0.5 pour une gamme de pH allant de 5.5 à 11. Après incubation à 45°C pendant le temps optimum de culture sous agitation, la culture est arrêtée par centrifugation et l’activité kératinolytique est détectée dans les surnageants de culture.
2.2.3. Température optimale d’incubation
Afin de rechercher la température optimale d’incubation pour cette souche, une gamme de
températures allant de 40 à 55°C a été testée. Le milieu de culture préparé est ajusté au pH n : le taux de dilution
4 : le volume réactionnel final (ml) 10 : le temps d'incubation (min).
Partie expérimentale
2.2.4. Effet des différents substrats kératiniques sur la production de kératinases
La production de kératinases par la souche Cpt29 a été étudiée par culture de cette souche sur milieu FBM substituant la farine de plumes par différents substrats kératiniques à savoir: la soie, la laine, les ongles, les plumes, la farine de plumes, les cheveux, lait écrémé, caséine et son de
blé. Après incubation dans les conditions favorables, l’activité kératinolytique est détectée dans
les surnageants de culture.
Effet des concentrations croissantes de la meilleure source de kératine sur la production de kératinases
La culture de la souche Cpt29 a été réalisée sur le milieu FBM additionné de différentes
concentrations de meilleur substrat kératinique (5, 10, 15, 20, 25, 30%) l’activité kératinolytique
est mesurée dans les surnageants de culture.
2.2.5. Effet des différentes sources de carbone sur la production de kératinases
Afin d’avoir une meilleure production de kératinases par la souche Cpt29, cette dernière a été cultivée sur milieu FBM additionné de différentes sources de carbone : amidon, lactose, galactose glucose, fructose et glycérol, le pH du milieu est ajusté au pH optimum. Après culture
dans les conditions optimales. L’activité kératinolytique est mesurée dans les surnageants de
culture.
Effet des concentrations croissantes de la meilleure source de carbone sur la production de kératinases
La culture de la souche a été réalisée sur le milieu FBM additionné de différentes concentrations de la meilleure source de carbone (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4%). Après incubation dans les conditions optimales l’activité kératinolytique est mesurée dans les surnageants de culture. 2.2.6. Effet des différentes sources d'azote sur la production de kératinases
La production de kératinases par la souche Cpt29 a été étudiée par culture sur milieu FBM
additionné de différentes sources d’azote organiques et inorganiques: NaNo2, NaNo3, (NH4)2So4,
KNo3, NH4No3, urée, extrait de levure, tryptone, peptone et extrait de malt. Après incubation
dans les conditions optimales l’activité kératinolytique est mesurée dans les surnageants de culture.
Partie expérimentale
Effet des concentrations croissantes de la meilleure source d’azote sur la production de kératinases
La culture de la souche a été réalisée sur milieu FBM additionnée de différentes concentrations de la meilleure source d’azote (0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4%). Après incubation dans les conditions optimales l’activité kératinolytique est mesurée dans les surnageants de culture. 2.2.7. Effet des différentes sources de phosphore sur la production de kératinases
La production de kératinases par la souche Cpt29 a été testée sur milieu FBM, substituant le
dipotassium hydrogène phosphate (K2HPO4) par différentes sources de phosphore : NH4H2PO4,
NaH2PO4, Na2HPO4, K2HPO4, KH2PO4. Après incubation dans des conditions favorables
l’activité kératinolytique est détectée dans les surnageants de culture.
Effet des concentrations croissantes de la meilleure source de phosphore sur la production de kératinases
La culture de la souche a été réalisée sur le milieu FBM additionné de différentes concentrations
de la meilleure source de phosphore (0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.125, 0.15%).
Après incubation dans les conditions optimales l’activité kératinolytique est mesurée dans les surnageants de culture.
Partie expérimentale
Chapitre 3 : Purification et caractérisation de la kératinase produite par la souche Cpt29 isolée et identifiée
La troisième partie de ce travail de recherche consiste à mettre en œuvre un protocole de
purification et caractérisation biochimique et physicochimique des enzymes kératinolytiques
secrétées par la souche d’Actinomycète thermophile Cpt29.
3.1. Préparation de l’extrait enzymatique à partir de la souche Cpt29
Les cellules bactériennes issues d’une culture (de 800ml) de la souche Cpt29 après incubation à
45°C pendant 7jours sur milieu FBM sont éliminées par centrifugation à 10000×g pendant
20min à 4°C. Le surnageant récupéré, contenant l’activité kératinolytique, est clarifié par
filtration.
Dosage de l’activité kératinolytique
L'activité kératinolytique dans cette partie de purification a été mesurée dans le surnageant de culture en utilisant la kératine-azure comme substrat selon le protocole modifié de Jaouadi (2010) [6] qui consiste à mélanger 1 ml de solution de kératine azure (10g/l), suspendu dans
le tampon glycine-NaOH 100mM (supplémenté avec 5mM de MnSo4 à pH 10) (Tampon A),
avec 1ml d'une solution d'enzyme convenablement diluée. L’ensemble a été incubé pendant
20min sous agitation à 250rpm à 70°C. Puis refroidi dans un bain de glace pendant 10min.
Les substrats non utilisés sont précipités par l’ajout de 1ml de TCA à 20% et éliminés par
centrifugation à 11000×g pendant 20min et par filtration. L’activité enzymatique a été
mesurée dans le filtrat de culture par mesure de l’absorbance à 440nm puis exprimée en unités
de kératine (UK). Les témoins sont préparés parallèlement dans les mêmes conditions mais avec un tampon sans substrat.
Une UK a été définie comme étant la quantité d'enzyme qui provoque une augmentation de
0,1 d’absorbance à 440nm en une minute dans les conditions décrites.
Détermination des activités spécifiques
L’activité spécifique (AS) est déterminée à partir de l’activité enzymatique et le taux de
protéines; c’est le nombre d’unité d’enzyme par unité de masse en protéines (en mg).
Unité d’activité
AS = Taux de protéines
Partie expérimentale
3.1.1. Précipitation fractionnée au sulfate d’ammonium
La précipitation est utilisée pour purifier partiellement et concentrer les protéines solubles dans le surnageant. Le sulfate d’ammonium entre en compétition avec les protéines pour réagir avec les molécules d’eau. Ceci entraîne une désolvatation suivie d’une précipitation. La précipitation
fractionnée des protéines a été réalisée par l’addition de sulfate d’ammonium solide en faible
quantité au surnageant de culture, sous agitation douce à 4°C jusqu’à 40% de saturation
(242g/l) ; après une nuit de décantation à 4°C les protéines précipités sont récupérées par centrifugation à 12000×g pendant 25min, le surnageant recueilli est additionné de sulfate d’ammonium solide jusqu’à 70% de saturation (136g/l). Après une nuit de décantation suivi par centrifuge à 12000×g pendant 25min. Le culot est remis immédiatement en suspension dans le minimum de tampon A (Annexe 2) (15ml) et dialysé à 4°C contre le même tampon pendant une
nuit. Cette préparation constitue l’extrait enzymatique brut ou dialysat qui sera utilisé pour
l’étude de l’activité kératinolytique produite par cette souche et pour la purification de l’enzyme. 3.1.2. Traitement thermique
Le surnagent obtenu subit un traitement thermique à 80°C pendant 30min, puis centrifugé
pendant 20min à 14000×g. Le surnageant contenant l’activité est récupéré pour la suite de la
purification. Cette opération a pour but de précipiter une fraction importante de protéines du surnageant par dénaturation thermique, ce qui a pour but d’augmenter l’activité spécifique de l’enzyme recherché.
3.2. Chromatographie d’exclusion-diffusion sur Sephacryl S-200
Cette chromatographie a été réalisée sur colonne Sephacryl S-200, ayant un diamètre de 2,5cm et une longueur de 80cm, préparée selon les indications du fabriquant. Le support a un domaine de fractionnement de 5 à 150kDa. Le gel qui se présente sous forme de poudre est mis à gonfler pendant 24h dans le tampon A contenant 50mM NaCl (Tampon B), puis à dégazer pour éliminer les bulles d’air. Une fois préparé, le gel est coulé délicatement sur la paroi de la colonne puis est lavé avec 3 volumes de tampon de travail avec un débit de 40ml/h. Après rééquilibrage de la colonne, 2ml de la préparation enzymatique brute sont déposés au sommet de la colonne
suivie de tampon de travail. L’élution est réalisée à un débit de 40ml/h et des fractions de 1.7ml
/tube sont recueillies.
Partie expérimentale