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Purification et caractérisation d’une kératinase thermostable KERAK-29 chez une nouvelle souche d’Actinomycète

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Academic year: 2021

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Texte intégral

(1)

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

Université Badji Mokhtar Annaba

Badji Mokhtar University

ر

اتخم

يجاب

ةعماج

Annaba ةبانع

FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE

Laboratoire de Biochimie et de Microbiologie appliquées Thèse

Présentée en vue de l’obtention du diplôme de Doctorat LMD (3ème Cycle)

Option : Biochimie Appliquée

Présentée Par

HABBECHE AMINA

Devant le jury :

Président : Mr : DJEGHABA Zinedine (Prof) Université Badji Mokhtar - Annaba

Directeur de thèse : Mr : LADJAMA Ali (Prof) Université Badji Mokhtar - Annaba

Examinateur : Mr : SOLTANE Mahmoud (Prof) Université d’El Tarf

Examinateur : Mr : SOUMATI Boudjemaa (MC A) Université Badji Mokhtar - Annaba Examinatrice : Mme : SOUIKI Linda (MC A) Université 8 Mai 1945 - Guelma

2013-2014

Purification et caractérisation d’une kératinase thermostable

(2)

Je dédie ce travail à mes très chers parents qui

m’ont menée pas à pas à la réussite

et à la concrétisation de mes objectifs

Je vous dois tout ce que je suis et tout ce que je serai, j’espère avoir été à la hauteur

de vos espérances

A ceux qui sont proches de mon cœur, mes chers frères : Samir et Amine.

A mes adorables sœurs : Amira et Nour

Et à toute ma famille maternelle et paternelle.

A la mémoire de mon amie Taibi Zina

Ainsi que tous mes amis et tous ceux qui me sont très chers

(3)

Ce travail a été réalisé au sein de Laboratoire de Recherche de Biochimie et Microbiologie Appliquée (LBMA), Département de Biochimie, Université Badji Mokhtar, sous la direction de Monsieur le Professeur Ali Ladjama, Professeur à l’Université Badji Mokhtar ANNABA et Directeur de laboratoire Mes remerciements s’adressent en premier lieu à mon Directeur de thèse Monsieur Ali Ladjama, qui a été

mon encadreur depuis mon Master en 2009, pour sa patience, ses encouragements, sa rigueur et son orientation dont j’ai pu bénéficier. Puisse ce travail vous exprime ma vive gratitude et mon grand estime

Je tiens à remercier vivement Monsieur DJEGHABA Z Professeur à l’Université Badji Mokhtar ANNABA, qui me fait l’honneur et l’immense plaisir de présider le jury de soutenance

C’est avec un très grand plaisir que je remercie infiniment Monsieur SOUMATI B Maître de Conférences à l’Université Badji Mokhtar ANNABA, d’avoir bien voulu juger ce travail. Qu’il trouve ici ma très

profonde gratitude.

Je remercie sincèrement Monsieur SOLTANE M Professeur à l’Université d’EL TAREF, d’avoir accepté de juger ce présent travail.

Je voudrais exprimer également ma sincère reconnaissance à Madame SOUIKI L Maître de Conférences à l’Université 8 Mai 1945 GUELMA, qui me fait l’honneur d’accepter d’examiner mon travail. Je tiens à remercier sincèrement mes collègues de l’équipe de LBMA à savoir: Soumaya, Boujemaa, Billal, Lazher pour leur aide précieuse, leurs conseils qu’ils m’ont toujours offerts. Qu’ils trouvent ici

l’assurance de ma reconnaissance et mes remerciements les plus distingués.

Je remercie Monsieur Jaouadi B Docteur au Centre de Biotechnologie de SEFAX, TUNISIE, pour son aide considérable et ses conseils.

Je remercie également Madame Belwatar S pour son aide, ses conseils et son amabilité.

Mes vifs remerciements s’adressent également à tous les enseignants qui ont contribué à ma formation tout au long de mes études

Mes sentiments de reconnaissance et mes remerciements vont également à l’encontre de toutes les personnes qui ont contribué de prés ou de loin à la réalisation de ce travail

(4)

ﺝﺎﺗﻧﺍ ﻭ ﺙﺣﺑﻟﺍ ﺭﺎﻁﺍ ﻲﻓ ﻻﺍ ﺕﺎﻣﻳﺯﻧ ﻟﺍ ﻧﻳﺗﺍﺭﻳﻛ ﺔﻳ ﻟﺍ ﺔﻣﻭﺎﻘﻣ ﻟ ﺓﺭﺍﺭﺣﻠ ﺔﻁﺳﺍﻭﺑ ﺕﺎﻧﺋﺎﻛ ﺔﻘﻳﻗﺩ ﺔﺑﺣﻣ ﺓﺭﺍﺭﺣﻠﻟ ، ﻝﺰﻋ ﻢﺗ ﺔﻟﻼﺳ ﺓﺩﻳﺩﺟ ﻥﻣ ﻭ (ﺭﺋﺍﺯﺟﻟﺍ ﻕﺭﺷ ﻝﺎﻣﺷ) ﺝﺎﺟﺩﻟﺍ ﺩﺎﻣﺳ ﻥﻣ ﺓﺭﺍﺭﺣﻠﻟ ﺔﺑﺣﻣﻟﺍ ﺕﺎﺳﻳﻣﻭﻧﻳﺗﻛﻻﺍ ﺗ ﺎﻬﻔﻴﻨﺼ ﺕﺎﻳﻧﻘﺗ ﺔﻁﺳﺍﻭﺑ ﺔﻴﻔﻴﻨﺼﺗ ﻘﻣ ﺔﻳﻛﻳﺳﻼﻛ ﺗ ﺔﻧﺭ ﺕﺎﻴﻨﻘﺘﺑ ﺔﻴﺌﻳﺰﺠﻟﺍ ﺎﻴﺟﻮﻟﻮﻴﺒﻟﺍ ﺔﺜﻳﺪﺤﻟﺍ ﻟﺍ ﺾﻤﺤﻟﺍ ﻞﺴﻠﺴﺗ ﺱﺎﺳﺃ ﻰﻠﻋ ﺒﻳﺮﻟﺍ ﻱﻭﻮﻨ ﻱﺯﻮ ﺔﺛﺭﻮﻤﻠﻟ ARNr 16S . ﺙﻳﺣ ﺎﻧﻟ ﻥﻳﺑ ﻝﻳﻠﺣﺗ ﻲﻧﻳﺟﻟﺍ ﻝﺳﻠﺳﺗﻟﺍ ﻪﻴﻠﻋ ﻞﺼﺤﺘﻤﻟﺍ ﺍﺭﻳﺩﻣﻭﻧﻳﺗﻛﻻﺍ ﻉﻭﻧ ﻰﻟﺍ ﺓﺩﻳﺩﺟﻟﺍ ﺔﻟﻼﺳﻟﺍ ﻩﺫﻫ ءﺎﻣﺗﻧﺍ ﺏ 99 ٪ ، ﻝﻳﻠﺣﺗﻟﺍ ﻙﻟﺍﺫﻛ ﺍﺭﻳﺩﻣﻭﻧﻳﺗﻛﻻﺍ ﻰﻟﺍ ﺔﻟﻼﺳﻟﺍ ﻩﺫﻫ ءﺎﻣﺗﻧﺍ ﺩﻛﺍ ﻲﻧﻳﺟﻭﻠﻳﻔﻟﺍ ﻳﺗﺍﺭﻳﻛ ﻧﻳ .ﺎﻛﻳﺗﻳﻠ ﺔﻟﻼﺳﻟﺍ ﺍﺭﻳﺩﻣﻭﻧﻳﺗﻛﻻﺍ ﺓﺭﺍﺭﺣﻠﻟ ﺔﺑﺣﻣﻟﺍ ﻳﺗﺍﺭﻳﻛ ﻧﻳ ﺎﻛﻳﺗﻳﻠ Cpt29 ﻁﺎﺷﻧ ﺕﻁﻋﺍ ﻲﻣﻳﺯﻧﺍ ﻰﻟﺍ ﻝﺻﻳ 39.62 ﻞﻣ/ﺔﻴﻟﻭﺩ ﺓﺪﺣﻭ . ﻦﻜﻟ ﻧﻋ ﺩ ﻮﻤﻨﻟﺍ ﻁﻭﺮﺷ ﻒﻠﺘﺨﻣ ﻂﺒﺿ ﺔﻟﻼﺴﻟﺍ ﻩﺬﻬﻟ ﻪﺳﺎﺳﺃ ﻞﺋﺎﺳ ﻂﺳﻭ ﻲﻓ ﺶﻳﺮﻟﺍ ﻕﻮﺤﺴﻣ ﺔﻄﺳﺍﻮﺑ ﻟﺍ ﺕﺎﻴﻨﻘﺘ ﻟﺍ ﻁﺎﺸﻨﻟﺍ ﻥﺍ ﺎﻧﺪﺟﻭ ﺔﻴﻜﻴﺳﻼﻜ ﻲﻤﻳﺰﻧﻻﺍ ﻒﻋﺎﻀﺗ ﺕﺍﺮﻣ ﺔﺛﻼﺛ ﻭ ﺢﺒﺻﺍ 135.23 ﺓﺩﺣﻭ ﺔﻳﻟﻭﺩ / ﻝﻣ ﻥﺎﻓ ﻪﻧﻣ ﻭ ﻁﺎﺷﻧﻟﺍ ﺍﺫﻫ ﻣ ﺭﺑﺗﻌﻣ ﻧﺭﺎﻘ ﺔ ﻝﺛﻣ ﻯﺭﺧﺍ ﺕﻻﻼﺳ ﻊﻣ ﺱﺎﺳﻳﻣﻭﺗﺑﺍﺭﺗﺳﻟﺍ ﻭ ﺱﻭﻠﻳﺳﺎﺑﻟﺍ . ﻲﻓ ﻟﺍ ءﺯﺟ ﻲﻟﺍﻭﻣﻟﺍ ﻟ ﺍﺫﻬ ﺔﻳﻘﻧﺗﺑ ﺎﻧﻣﻗ ،ﻝﻣﻌﻟﺍ ﻡﻳﺯﻧﺍ ﺩﻳﺩﺣﺗ ﻭ ﺯﺎﻧﻳﺗﺍﺭﻛﻟﺍ ﻪﺻﺋﺎﺻﺧ ﺔﻳﺋﺎﻳﻣﻳﻛﻭﻳﺑﻟﺍ ، ﻓ ﻥﻣ ﻝﻼﺧ ﺓﺭﺟﻬﻟﺍ ﺕﺎﻳﻧﻘﺗ ﺔﻳﺋﺎﺑﺭﻬﻛﻟﺍ ﻭ ﻝﻳﻠﺣﺗﻟﺍ ﻲﻔﻳﻁﻟﺍ ،ﻝﻣﺎﺷﻟﺍ ﺎﻧﺭﻬﻅﺃ ﻡﻳﺯﻧﻻﺍ ﻥﺃ (KERAK-29) ، ﺏ ﺭﺪﻘﻳ ﻲﺌﻳﺰﺟ ﻥﺯﻭ ﻪﻟ ﻭ ﻱﺩﺎﺣﺍ : 29.2331 ﻭﻠﻳﻛ .ﻥﻭﺗﻟﺍﺩ ﻭ ﻝﻳﻠﺣﺗ ﺔﻠﺳﻠﺳﻟﺍ ) N-terminal ( ﻱﻭﺣﺗ ﻲﺗﻟﺍ 25 ﻡﻳﺯﻧﻻ ﻲﻧﻳﻣﺍ ﺽﻣﺣ ) (KERAK-29 : TQADPPSWGLNNIDRQTAFTKATSI ﻥﻳﺑ ﺔﻳﻟﺎﻋ ﻝﺛﺎﻣﺗ ﺔﺑﺳﻧ ﺯﺎﻳﺗﻭﺭﺑ ﻊﻣ ﻯﺭﺧﺍ ﻥﻣ .ﺱﺎﺳﻳﻣﻭﺗﺑﺍﺭﺗﺳﻟﺍ ﻉﻭﻧ ﻥﺍ ﺎﻣﻛ ﺔﺳﺍﺭﺩ ﺭﻳﺛﺄﺗ ﺽﻌﺑ ﺕﺎﻁﺑﺛﻣﻟﺍ ﻧﻳﺑ ﺕ ﻥﺍ PMSF ﻭ DFP ﻄﺒﺜﻳ ﻥﺎ ﺎﻤﻣ ﻲﻤﻳﺰﻧﻻﺍ ﻁﺎﺸﻨﻟﺍ ﺎﻴﻠﻛ ﻢﻳﺰﻧﻻﺍ ﺍﺬﻫ ﻞﻌﺠﻳ ﻒﻨﺼﻳ ﻲﻓ ﺔﻠﺋﺎﻋ ﺯﺎﻳﺗﻭﺭﺑ ﻥﻳﺭﻳﺳ . ﺎﻣﺍ ﺎﺗﺟﺭﺩ ﺔﺿﻭﻣﺣﻟﺍ ﺓﺭﺍﺭﺣﻟﺍﻭ ﺎﺗﻠﺛﻣﻟﺍ ﻁﺎﺷﻧﻟ ﻥ ﻡﻳﺯﻧﺍ (KERAK-29) ﺎﻣﻫ ﻰﻠﻋ ﻲﻟﺍﻭﺗﻟﺍ 10 ﻭ 70 ﺔﻳﻭﺋﻣ ﺔﺟﺭﺩ . ﻥﺍ ﺎﻣﻛ ﺍﺫﻫ ﺭﺍﺭﻘﺗﺳﺍ ﻩﺎﺻﻗﺍ ﻎﻠﺑﻳ ﺯﺎﻳﺗﻭﺭﺑﻟﺍ ﻦﻴﺑ ﺎﻣ ﺟﺭﺩ ﺔ ﺔﺿﻮﻤﺣ 6 ﻭ 1 1 ، ﻭ ﺕﺎﺟﺭﺩ ﻲﻓ ﺓﺭﺍﺭﺣﻟﺍ 70 ، 80 ﻭ 90 ﺔﺟﺭﺩ ﺔﻳﻭﺋﻣ ﻲﻓ ﺩﻭﺟﻭ 2 + n M . ﻦﻣ ﻟﺍ ﺔﻴﺣﺎﻨﻟﺍ ﺔﻴﻘﻴﺒﻄﺘ ، ﻥﺎﻓ ﺪﻳﺪﺠﻟﺍ ﻢﻳﺰﻧﻻﺍ ﺍﺬﻫ ) (KERAK-29 ﻱﺬﻟﺍ ﺮﻬﻅﺍ ﺹﺋﺎﺻﺧ ﺔﻳﺋﺎﻳﻣﻳﻛﻭﻳﺑ ﺔﺻﺎﺧ ) ﻲﻓﺭﺍﺭﻘﺗﺳﺍ pH ﻱﺩﻋﺎﻗ ﻭ ﺕﺎﺟﺭﺩ ﻟﺍ ﺓﺭﺍﺭﺣ ﻟﺍ ﺔﻳﻟﺎﻌ ( ﻥﻛﻣﻳ ﻥﺃ ﻡﺩﺧﺗﺳﻳ ﺡﺎﺟﻧﺑ ﻲﻓ ﺕﺎﻘﻳﺑﻁﺗ ﺎﻳﺟﻭﻟﻭﻧﻛﺗﻟﺍ ،ﺔﻳﻭﻳﺣﻟﺍ ﺔﺻﺎﺧﻭ ﻲﻓ ﺎﻋﺍ ﺓﺩ ﻞﻳﻮﺤﺗ ,ﺵﻳﺭﻟﺍ ﺝﻼﻋ ﺩﻭﻠﺟﻟﺍ , ﺩﻳﺗﺑﺑﻟﺍ ﺝﺎﺗﻧﺍ ﺕﺍ ﻭ ﺕﺎﻔﻈﻨﻤﻟﺍ . ﻟﺍ ﺕﺎﻤﻠﻜﻟﺍ ﺡﺎﺘﻔﻤ : ﺗﻭﺮﺒﻟﺍ ﻴﻴ ﺎ ﺯ ؛ ﻟﺍ ﺯﺎﻨﻴﺗﺍﺮﻴﻜ ؛ ﺕﺎﺴﻴﻣﻮﻨﻴﺘﻛﻻﺍ ﺓﺭﺍﺮﺤﻠﻟ ﺔﺒﺤﻤﻟﺍ ؛ ﺗ ﻠﺤ ﻴ ﻦﻴﺗﺍﺮﻴﻜﻟﺍ ﻞ .

(5)

As part of the research of the thermostable keratinolytic enzymes production by thermophilic microorganisms, a new strain of thermophilic Actinomycetes Cpt29 was isolated from chicken compost (North East Algeria) and identified by standard taxonomic methods coupled with molecular biology based on sequencing the 16S rRNA gene. The analysis of the sequence obtained by alignment has linked this new strain Cpt29 to the genus “Actinomadura” with 99 % of similarity and phylogenetic analysis confirms that the strain is

related to the species Actinomadura keratinilytica. Thermophilic strain Actinomadura

keratinilytica Cpt29 has a keratinolytic activity of the order of 39.62 IU/ml. Thereafter, we proceeded to optimize the production of the keratinases by conventional method. After optimization of culture conditions of this strain on a liquid medium containing feather meal, we tripled the activity to 135.23IU/ml, this activity remains competitive compared to

those obtained in the genus Bacillus and Streptomyces, 67.4IU/ml and 37IU/ml respectively.

In another part of the work, we purified searched keratinase and determined its biochemical properties, and by electrophoresis techniques (SDS-PAGE) and mass spectroscopy (MADI-TOF/MS), we showed that the enzyme was monomeric and has a molecular weight of 29.2331 kDa. Moreover the analysis of the N- terminal sequence of 25 amino acid residues of the KERAK-29: TQADPPSWGLNNIDRQTAFTKATSI presented a high homology with

other proteases of the genus Streptomyces. The study of the effect of some inhibitors showed

that PMSF and DFP completely inhibit the enzyme activity which means it belong to the family of serine proteases. The optimum pH and temperature are respectively pH 10 and 70°C. The study of thermo-stability and pH stability has shown that KERAK-29 has a high stability between pH 6-11, and keeps its activity in temperatures of 70, 80 and 90°C in the

presence of Mn2 +.

The KERAK-29 which has specific biochemical characteristics (alkalinity, high thermal stability and high stability in the presence of detergents) could be successfully used in biotechnological applications, especially in the recovery of waste feathers, leather treatment, peptide synthesis and detergency.

(6)

Dans le cadre de la recherche et la production d’enzymes kératinolytiques thermostables chez les microorganismes thermophiles, une nouvelle souche d'Actinomycète thermophile Cpt29 est isolée à partir du compost de poulet (Nord Est Algérie) et identifiée par des méthodes taxonomiques classiques couplées à la biologie moléculaire en se basant sur le séquençage du

gène d’ARNr 16S. L’analyse de la séquence obtenue par alignement a permis de rattacher

cette nouvelle souche Cpt29 au genre «Actinomadura» avec 99% de similarité, ainsi l’analyse

phylogénique confirme bien l’apparenté de cette souche à l’espèce Actinomadura

keratinilytica. La souche thermophile Actinomadura keratinilytica Cpt29 présente une activité

kératinolytique de l’ordre de 39.62 UI/ml. Par la suite, nous avons procédé à l’optimisation de

la production des kératinases par méthode classique. Après optimisation des conditions de culture de cette souche sur un milieu liquide à base de farine de plumes, nous avons triplé cette activité, soit 135.23 UI/ml. Cette activité reste compétitive par rapport à celles obtenues

chez le genre Bacillus et Streptomyces.

Dans une autre partie du travail, nous avons purifié la kératinase recherchée et déterminé ses

propriétés biochimiques. Ainsi, par techniques d’électrophorèse (PAGE-SDS) et

spectroscopie de masse (MADI-TOF/MS), nous avons montré que l'enzyme KERAK-29 est

monomérique et présente une masse moléculaire de 29,2331 kDa. Par ailleurs l’analyse de la

séquence N-terminal des 25 résidus d’acides aminés de la KERAK-29 :

TQADPPSWGLNNIDRQTAFTKATSI présente une grande homologie avec d’autres

protéases du genre Streptomyces. L'étude de l'effet de certains inhibiteurs a montré que le

PMSF et DFP inhibent totalement l'activité enzymatique ce qui rattache cette enzyme à la famille des protéases à serine. Les optima de pH et température de la KERAK-29 sont respectivement pH 10 et 70°C. L'étude de la stabilité de cette protéase vis à avis du pH alcalin et de température élevée montre que la KERAK-29 présente une haute stabilité entre pH 6-11

et une bonne thermostabilité à 70, 80 et 90°C en présence du Mn2+.

Du point de vue application, cette nouvelle KERAK-29 ayant des caractéristiques biochimiques particulières (alcalinité, thermostabilité élevée et une stabilité importante en présence de détergents) pourrait être utilisée avec succès dans des applications biotechnologiques notamment dans la valorisation des déchets de plumes, le traitement de

(7)

Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux

Introduction générale………... 1

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre 1 Les protéases kératinolytiques 4 1.1. Les protéases………..……. 4

1.1.1. Classification des protéases………..…. 4

1.1.1.1. Selon la localisation cellulaire………...…... 6

1.1.1.2. Selon la nature de leur site catalytique……….… 6

1.1.1.3. Selon leur besoin en ATP……….……… 10

1.1.2. Marché mondial et origine des protéases………..……….... 13

1.1.3. Application des protéases en biotechnologie……….... 14

1.2. Les kératinases……….... 15

1.2.1. Définition et mode d’action des kératinases……….. 15

1.2.2. Origine des kératinases………..… 17

1.2.3. Physiologie de la production des kératinases……….... 17

1.2.4. Propriété physicochimiques des kératinases……….…… 19

1.3. Les substrats kératiniques………..… 21

1.3.1. Structure des kératines………...……… 21

1.3.2. Classification des kératines………...… 22

1.3.3. Source des kératines……….. 24

1.3.4. Valorisation de déchets de plumes……….... 26

1.4. Applications des protéases kératinolytiques en biotechnologie…………...……….. 27

1.4.1. Traitement de cuir et caractéristique de l’effluent de tannerie……...………….…. 27

1.4.2. Industrie de détergents……….….. 29

1.4.3. Traitement des déchets kératiniques……….. 29

1.4.3.1. Production de farine de plumes pour alimentation animale………..…...…. 29

1.4.3.2. Production de farine de plumes comme engrais………...….. 30

(8)

1.4.6. Utilisation des kératinases microbiennes dans l’hydrolyse des amyloïdes……... 31

1.4.7. Autres applications………...……….… 31

Chapitre 2 Importance des Actinomycètes dans la production des kératinases 32 2.1. Les caractéristiques principales des Actinomycètes………..…... 32

2.2. Ecologie et distribution des Actinomycètes dans la nature…………...…….… 33

2.3. Taxonomie des Actinomycètes ………...………. 35

2.3.1. Evolution de la taxonomie des Actinomycètes ………... 35

2.3.2. Classification des Actinomycètes ……… 36

2.4. Les caractéristiques biologiques des Actinomycètes ……….. 38

2.5. Production des kératinases par des souches du genre Actinomadura…………...… 39

Partie expérimentale

MATERIELS ET METHODES Chapitre 1 Recherche et identification d’une souche d’Actinomycètes thermophile productrice de kératinases isolée à partir du compost de poulet 40 1.1. Echantillonnage et isolement taxonomique………...….. 40

1.2. Détection de l’activité protéolytique et kératinolytique chez la souche Cpt29 sur milieu solide (Test semi- quantitatif) ………..………..……..…. 41 1.3. Identification moléculaire (ARNr 16S) et analyse phylogénétique de la souche Cpt29………..……... 41 1.3.1. Extraction de l’ADN génomique (ADNg) à partir de la souche d’Actinomycète Cpt29……….………….…. 42 1.3.2. Analyse de l’ADNg par électrophorèse sur gel d’agarose………...….… 42

1.3.3. Dosage de l’ADN………... 42

1.3.4. Amplification génique de l’ADN par technique PCR………..…. 43

1.3.5. Préparation d’ADN plasmidique (ADNp)………. 43

(9)

Chapitre 2

Optimisation des conditions de culture pour la production des kératinases par la souche d’Actinomycète Cpt29

45

2.1. Différentes méthodes de dosage utilisées dans l’optimisation des conditions de

culture……….……….

45

2.1.1. Dosage de l’activité protéolytique………..….……….…….… 45

2.1.2. Dosage de l’activité kératinolytique……….…. 46

2.1.3. Dosage des protéines……….…… 47

2.2. Optimisation des conditions de culture pour de la production de kératinases par la souche CPt29………...………...…… 47 2.2.1. Temps optimum d’incubation……….….. 47

2.2.2. pH optimum de culture………. 47

2.2.3. Température optimal d’incubation………... 47

2.2.4. Effet des différents substrats kératiniques sur la production de kératinases………. 48

2.2.5. Effet des différentes sources de carbone sur la production de kératinases………... 48

2.2.6. Effet des différentes sources d'azote sur la production de kératinases………..…… 48

2.2.7. Effet des différentes sources de phosphore sur la production de kératinases……... 49

Chapitre 3 Purification et caractérisation de la kératinase produite par la souche Cpt29 isolée et identifiée 50 3.1. Préparation de l’extrait enzymatique à partir de la souche Cpt29……… 50

3.1.1. Précipitation fractionnée au sulfate d’ammonium………....…….…... 51

3.1.2. Traitement thermique………...…... 51

3.2. Chromatographie d’exclusion-diffusion sur Sephacryl S-200……….………... 51

3.3. Analyse de la pureté par électrophorèse en conditions dénaturante (PAGE-SDS) 52 3.3.1. Analyse de l’enzyme étudiée par zymogramme……….….. 52

3.4. Caractérisation biochimique et physicochimique de la kératinase purifiée………. 52

3.4.1. Effet du pH sur l’activité et la stabilité de l’enzyme……….………..….. 52

3.4.2. Effet de la température sur l’activité et sur la stabilité de l’enzyme………... 53

3.4.3. Effet des ions métalliques sur l’activité enzymatique……….…….. 53

3.4.4. Effet des inhibiteurs sur l’enzyme………..…... 53

3.4.5. Effet des tensioactifs sur l’activité et la stabilité de la kératinase étudiée ….…….. 54

(10)

3.6. Détermination du poids moléculaire de l’enzyme par spectrométrie de masse

(MALDI-TOF)……….………..…….

54

3.7. Mise en évidence de la dégradation des plumes par l’enzyme purifiée…..……..…. 54

RESULTATS ET DISCUTIONS

Chapitre 1

Identification et classification d’une nouvelle souche d’Actinomycète

thermophile Cpt29

55

1.1.Taxonomie phénotypiques ……….… 55

1.2. Mise en évidence de l’activité protéolytique de la souche Cpt29 sur milieu solide 57

1.3. Mise en évidence de l’activité kératinolytique de la souche Cpt29 sur milieu solide 57

1.4. Identification moléculaire de la souche Cpt29……….. 59

1.4.1. Analyse phylogénétique...……...……… 62

Conclusion …..…….………..………...…… 64

Chapitre 2

Optimisation des conditions de culture pour la production des kératinases par

la souche Actinomadura sp Cpt29

65

2.1. Production de protéases kératinolytiques par la souche Akeratinilytica Cpt29 sur

milieuliquide…………..………..……….………..………

65

2.2. Recherche des conditions optimales de culture pour la production de kératinases 66

2.2.1. Le temps optimum d’incubation……….………... 66

2.2.2. Le pH optimum de culture……….……… 66

2.2.3. La température optimale de culture……….……….. 66

2.2.4. Effet des différents substrats kératiniques sur la production de kératinases par la

souche A keratinilytica Cpt29…...…..………

68 2.2.5. Effet de l’addition de différentes sources de carbone sur la production de

kératinases par la souche Cpt29……..………...

70 2.2.6. Effet de l’addition de différentes sources d’azote sur la production de kératinases

par la souche Cpt29…………..………...……...

72

2.2.7. Effet des différentes sources de phosphore sur la production de kératinases par la …………..…….……….……..

(11)

Chapitre 3

Purification et caractérisation de l’enzyme KERAK-29

77

3.1. Purification ………..………...………… 77

3.2. Caractérisation de la kératinase «KERAK-29» purifiée………...….……..….. 79

3.2.1. Contrôle de la pureté de l’enzyme par PAGE-SDS et de l’activité enzymatique

par zymogramme………..……….……….

79

3.2.2. Détermination de la taille de la KERAK-29 par méthode (MALDI-TOF/MS)..… 79

3.2.3. Séquençage de l’extrémité NH2-terminale de la KERAK-29……….………….…. 81

3.2.4. Effet du pH sur l’activité et la stabilité de la KERAK-29 ………...………. 82

3.2.5. Effet de la température sur l’activité de la KERAK-29 ………...… 84

3.2.6. Effet des ions bivalents sur l’activité et la thermostabilité de la KERAK-29….… 86

3.2.7. Effet des inhibiteurs et des agents réducteurs sur l’activité de la KERAK-29……. 86

3.2.8. Effet de certains additifs de détergents sur l’activité et la stabilité de la KERAK29 88

3.3. Dégradation des plumes de poulet par la KERAK-29……….…… 88

Conclusion ………..…... 90 Conclusion générale………... 91 Annexes Annexe 1………..……….... 94 Annexe 2……….. 97 Références bibliographiques... 108

(12)

Abréviation Signification

APS persulfate d'ammonium

ATZ-Aa AnilinoThia Zolinone d'acide aminé

BET bromure d’ethidium

BLAST (Basic Local Alignement Search Tool)

CBS Centre de Biotechnologie de Sfax

CM Milieu Complet

Cpt Compost poulet thermophile

DFP di-isopropyl flurophosphate DMSO diméthylsulfoxyd DO Densité optique DTNB 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) DTT Dithiotreitol EC Enzyme Commission

EDTA acide ethylène diamine tétracétique

ESI Ionisation par Electronébuliseur

FBM Milieu à base de farine de plumes

FPP Farine de plume de poulet

GAE Groupe Avicole de l’Est

GNL Gélose Nutritive au Lait

HEPES acide 4-(2-hydroxy ethyl)-1-piperazine ethane sulfonique

HPLC Chromatographie en phase liquide à haute performance

ISP International Streptomyces Project

IUBMB Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire

LAS alkylbenzène sulfonates

LB Luria Broth

(13)

MOPS 3 N-morpholino propanesulfonic acid

MS Mycélium végétatif

MS Spectrometrie de masse

NCBI Centre National de l’Information Biotechnologique

NEM N-Ethylmaleimide

PAGE- SDS Electrophorèse en Gel de polyacrylamide contenant du

Dodécylsulfate de Sodium

PCMB P-chloro mercuri benzonate

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PITC Phénylisothiocyanate

PM Poids moléculaire

PMSF Florure de phényl méthyl sulphonyl

PTC Phénylthiocaramyl

PTH-Aa Phénylthiohydantoin d'acide aminé

SAB Sérum albumine bovine

SAE Société des Abattoirs de l’Est

SBT Soybean trypsin inhibitor

SEA Société des Abattoirs de l’Est algérien

STTP Tripolyphosphate de Sodium

TAE Tris-acétate EDTA

TAED Tétra acétyl ethyléne diamine

TBE Tris-borate EDTA

TCA acide trichloroacetique

TEMED N, N, N’, N’-tétramethyl-1-,2-diaminométhane-toxique

TFA acide trifluoro-acétique

TLCK (Tosyl lysine chloromethyl ketone)

TPCK (Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone)

UFC (Unite Forming Colony)

UI Unité Internationale

(14)

Formule Nom IUPAC

NH4H2Po4 dihydrogénophosphate d'ammonium

NaH2Po4 dihydrogénophosphate de sodium

Na2HPo4 hydrogénophosphate de sodium

K2HPo4 monohydrogénophosphate de potassium

KH2Po4 dihydrogeno phosphate de potassium

NaOH hydroxyde de sodium

NaNo2 nitrite de sodium

NaNo3 nitrate de sodium

NaCl chlorure de sodium

NH4No3 nitrate d’ammonium

KNo3 nitrate de potassium

KCl chlorure de potassium

NaCl chlorure de sodium

MgCl chlorure de magnesium

BaCl2 chlorure de baryum

CaCl2 chlorure de calcium

CaCo3 carbonate de calcium

(NH4)2So4 sulfate d'ammonium

MnSo4 sulfate de manganese

MgSo4 sulfate de magnesium

CuSo4 sulfate de cuivre

ZnSo4 sulfate de zinc

CoSo4 sulfate de cobalt

FeSo4 sulfate de fer

HgSo4 sulfate de mercure

(15)

Figure Titre Page

1 Répartition du marché mondial des enzymes 5

2 Structure en ruban d’une protéase à cystéine « la Papaïne » 9

3

(a) Structure tridimensionnelle d’une métallo enzyme de conversion ACE

(b) Présentation schématique du site active de cette enzyme avec le Glu384, His387, His383, Glu411 et Zn

9

4 Structure en ruban d’une peptidase aspartique : la rénine ="pepsine-like" et

présentation de sont site actif avec les deux résidus d’Acides aspartiques 11

5

Structure de la protéase à sérine « la chymotripsine » : Le groupe réactif au site actif est constitué d'une triade catalytique; la Ser 195 (l'acide aminé qui réagit avec le substrat), l'His 57 et l'acide Asp 102

11

6 Présentation du cycle catalytique des protéases à sérine (chymotrypsine) qui se

décompose en quatre étapes majeures 12

7 Structure en ruban d’une kératinase complexe 16

8

(a) Schéma représentant le mode d’action des kératinase sur les substrats kératiniques par clivage des ponts disulfures

(b) Représentation schématique des ponts disulfures entre les résidus de cystéines

16

9 Représentation schématique de l’organisation de la protofibrille de la structure

primaire de l’α-kératine de la chevelure humaine 23

10 Représentation schématique de l’organisation de la protofibrille de la structure

segondaire de la β-kératine et des ponts disulfures de la chevelure humaine 23

11 Schéma de la structure d’une plume 25

12 L’accumulation des déchets de plumes issus de l’industrie de la volaille 26

13 (a) Foulons, d’une mégisserie, contenant des peaux à traités.

(b) des photos présentent les différentes étapes de tannage de cuir 28

14 Aspect morphologique de la souche d’Actinomycète Cpt29 sur milieu ISP2 56

(16)

16 Mise en évidence d’activités kératinolytiques de la souche Cpt29 sur milieu à

base de farine de plumes (test semi-quantitatif) 58

17 Analyse du produit PCR (taille attendue) de l’amplification du gène codant

pour l’ARNr 16S de la souche la souche cpt29 60

18 Carte de restriction de plasmide pAH-16S 60

19 Séquence nucléotidique du gène d’ARNr 16S (1501 pb) de la souche Cpt29 61

20

L’arbre phylogénétique basé sur l’analyse des séquences d’ARN 16S et montrant la position taxonomique de la souche Cpt29 par rapport aux autres souches types des espèces du genre Actinomadura.

63

21 Temps optimum d’incubation pour la production de kératinases par la souche

A keratinilytica Cpt29 67

22 Effet du pH du milieu sur la production de kératinases par la souche Cpt29 67

23 Effet de la température d’incubation sur la production de kératinases par la

souche Cpt29 67

24 Effets des différants substrats kératiniques sur la production de kératinases par

la souche Cpt29 69

25 Effet de concentrations croissantes en farine de plumes sur la production de

kératinases par la souche Cpt29 69

26 Effet des différentes sources de carbone sur la production de kératinases par la

souche Cpt29 71

27 Effet des différentes concentrations de galactose sur la production de

kératinases 71

28 Effet des différentes sources d’azote sur la production de kératinases par la

souche Cpt29 73

(17)

31 Effet des différentes concentrations de K2HPO4 sur la production de

kératinases 75

32 Profil d’élution à la sortie de la colonne de filtration Sephacryl S-200 78

33 Profil électrophorétique sur SDS-PAGE à 15 % des différentes étapes de

purification 80

34 Profile d’analyse par spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS) 80

35 Effet du pH sur l’activité de la KERAK-29 de la souche Cpt29 83

36 Effet du pH sur la stabilité de la KERAK-29 83

37 Effet de la température sur l’activité de la KERAK-29 produite par Cpt29 85

38 Effet de Mn2+ sur la termostabilité de la KERAK-29 à 70, 80 et 90°C 85

39 Action de la KERAK-29 sur les plumes entières 89

40 Carte de restriction du vecteur de séquence pGEM-T Easy. 100

41 Courbe d’étalonnage de SAB 102

42 Courbe d’étalonnage de tyrosine 102

43 Dégradation chimique d’EDMAN automatisée sur microséquenceur de

protéines 105

(18)

Tableau Titre Page

1 Principales classes d’enzymes 5

2 Classification des protéases 7

3 Les microorganismes les plus connus pour la production de kératinases

hyperactives avec des propriétés physicochimiques extrêmes 18

4 Propriétés physicochimiques des kératinases microbiennes 20

5 Concentration des acides aminés en gramme par Kg de plumes 25

6 Répartition des Actinomycètes dans la nature 34

7 Classification des Actinomycètes 36

8

Les séquences des différents oligonucléotides utilisés dans cette étude

pour les amplifications du gène de l’ARNr 16S de la souche

d’Actinomycète Cpt29

44

9 Résultat de l’alignement du gène de l’ARNr 16S de la souche Cpt29

avec la banque de NCBI. 61

10 Différentes étapes de purification de la KERAK-29 de A keratinilytica

Cpt29 77

11 Alignement de la sequence NH2-terminale de la kératinase KERAK-29

avec celles des banques de données 81

12 Effet des ions bivalents sur la stabilité de la KERAK-29 87

13 Effet des inhibiteurs, d’agents réducteurs et des ions bivalents sur la

stabilité de la KERAK-29 87

14 Effet de certains additifs de détergents sur l’activité et la stabilité de la

KERAK-29 89

(19)
(20)

Parmi les hydrolases, les protéases sont les enzymes les plus recherchées dans les bioindustries et l’agro-alimentaire. En effet, elles sont les plus dominantes (environ 65%) dans le marché

mondial de ventes d’enzymes industrielles qui se situent entre 50 et 60 milliards euros par an,

ainsi il existe de nombreuses prévisions concernant l’évolution de ce marché qui peut atteindre

300 milliards euros d’ici 2030 [1, 2, 3]. Toutefois, cette part d’enzymes commercialisées est

dominée par les protéases alcalines utilisées notamment dans la détergence. Ces protéases actives et stables dans des conditions de pH extrêmes occupent approximativement 40% du marché

mondial d’enzymes [4]. Ces protéases sont ubiquistes et sont extraites aussi bien chez les

microorganismes, que chez les animaux et les végétaux. Dans le domaine de la biotechnologie industrielle, les microorganismes restent la source la plus importante pour la production de

protéases à caractère agro-alimentaire et industriel. Chez les bactéries, le genre Bacillus est le

genre le plus étudié dans la production et la commercialisation des protéases [5,6]. Chez les

champignons microscopiques, les protéases neutres commerciales sont produites par l’espèce

Aspergillus oryzae qui présente la source la plus dominante de protéases ayant un avantage pour l’enlèvement de l’amertume des aliments [7]. Ces protéases d’origine microbiennes sont souvent optimisées, purifiées et caractérisées pour être utilisées dans différents domaines industriels

notamment la détergence, la tannerie, l’industrie de textile, l’industrie agroalimentaire et d’autres

secteurs économiques [8, 9]. Parallèlement, la biotechnologie industrielle a évolué au cours de ces dernières années grâce à la biologie moléculaire et offre donc un ensemble d’outils puissants (clonage, mutagenèse dirigée et la modélisation moléculaire) pour développer et optimiser l’efficacité des procédés biotechnologiques. Cette augmentation de l’efficacité et de la sélectivité

offre des possibilités immenses pour une industrie durable préservant ainsi l’environnement et la

santé humaine.

De même, aujourd’hui, les travaux de recherches sur les protéases sont de plus en plus orientés vers une recherche appliquée. Ainsi, les bioindustries et les agro-industries sont de plus en plus exigeantes en matière de thermostabilité, de stabilité vis-à-vis des solvants organiques, de détergents et pH alcalin. A cet effet, les procaryotes thermophiles et hyperthermophiles constituent une source d'enzymes supérieures aux biocatalyseurs traditionnels par leurs propriétés uniques: thermostables, thermoactives, actives en présence des solvants organiques,

(21)

de molécules bioactives peu conventionnelles issues de mécanismes biochimiques et moléculaires uniques. Ainsi, les protéases de ces microorganismes tolérants offrent des avantages majeurs et fournissent de nouvelles possibilités soit de l’amélioration ou de la création

de nouveaux procédés biotechnologiques. L’exploitation de ces enzymes a permis l’élaboration

de produits de haute valeur, utilisés dans les industries chimiques, pharmaceutiques, cosmétiques, alimentaires et du textile. Les nouvelles propriétés de ces protéases ont également révolutionné la biotechnologie avec leur exploitation dans différentes applications comprenant la synthèse des acides nucléiques, des acides aminés et l’étude des structures protéiques [11, 12]

Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la recherche de protéases en l’occurrence des

kératinases thermostables produites par des Actinomycètes autochtones thermophiles issues du compost de poulet qui est connu pour abriter des microorganismes thermophiles. Les kératinases sont des protéases produites par des microorganismes qui dégradent la kératine des cheveux, de la laine, et des plumes avec une grande spécificité pour produire d'acides aminés essentiels. Les kératinases sont également utilisées dans le tannage du cuir et dans diverses autres applications comme la valorisation de certains déchets kératiniques tels que, les plumes, les poils, les sabots et les ongles (qui sont riches en kératine, collagène, élastine, albumine, et en acides aminés et peptides à haute valeur ajoutée) [13]. En effet, en Algérie, les déchets de plumes sont produits en

grande quantité par les industries de la volaille. L’accumulation de ces derniers a une

conséquence sur la pollution de l’environnement et la santé publique. Les kératinases étudiées

sont plutôt recherchées chez les champignons et certaines bactéries du genre Bacillus et

Streptomyces principalement.

En Algérie, très peu de travaux de recherches [14, 15] s’intéressent à la production et la

caractérisation des protéases microbiennes et particulièrement celles produites par les

Actinomycètes thermophiles, alors que la production des protéases kératinolytiques n’a pas été

abordée, toute fois, nous signalons une seule étude effectuée sur la kératinase alcaline «KERAB» [6] produite par la souche Streptomyces sp AB1.

Dans ce contexte que ce situe le présent travail de recherche qui a pour objectifs :

 Une étude théorique par une recherche bibliographique qui cadre le sujet de travail  Une étude expérimentale se présentant comme suite :

(22)

- Recherche et identification d’une souche d’Actinomycète thermophile autochtone isolée à partir du compost de poulet dans la région d’Annaba capable de produire des protéases kératinolytiques thermostables qui seront les plus performantes possible afin de répondre aux exigences des applications industrielles.

- Optimisation des conditions de culture pour la production de kératinases thermostables

par la souche Cpt29.

- Purification et caractérisation biochimique de la kératinase purifiée (KERAK-29).

- Essais d’application de l’enzyme pure à petite échelle sur des plumes de poulet entières et

(23)
(24)

Chapitre 1 : Les protéases kératinolytiques 1.1. Les protéases

Les enzymes sont divisées en plusieurs classes selon leur mode d’action spécifique. Chacune de

ces classes principales est décrite dans le Tableau 1 [16]. Au niveau industriel, la classe d’enzyme la plus exploitée est celle des hydrolases. Parmi ces dernières, les protéases représentent le groupe le plus connu, le plus commercialisé dans le marché mondial des enzymes (Figure 1) et le plus utilisé en biotechnologie industrielle [6]. En effet, les protéases sont des

enzymes qui catalysent l’hydrolyse des protéines en scindant la liaison peptidique avec différents

degrés de spécificités [4]. Ces enzymes sont ubiquitaires elles peuvent être d’origine végétale

(papaïne et bromeline), animal (chymosine, pepsine, trypsine et chymotrypsine) ou microbienne.

Cependant, la majorité des protéases commercialisées sont d’origine microbienne, car ces

enzymes sont plus stables vis-à-vis de la température, du pH et de certains détergents par rapport

aux protéases d’origine animale ou végétale. En effet, beaucoup de ces protéases microbiennes

sont produites à l’échelle industrielle grâce à leurs propriétés physicochimiques [2, 3] et sont recherchées par le marché mondial des enzymes [17]

1.1.1. Classification des protéases

Les recommandations pour la nomenclature des enzymes ont été regroupées dans une liste EC

(Enzyme Commission), publiée la première fois en 1954 puis en 1992 par l’Union Internationale

de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB). Depuis, cette liste est régulièrement actualisée dans les revues scientifiques de biochimie. Selon le comité de nomenclature de l’IUBMB, les enzymes protéolytiques appartiennent au sous-groupe 4 du groupe 3 (Hydrolases) d’où l’adoption de la nomenclature (EC 3.4.) [4].

D’une manière générale, les protéases sont classées selon plusieurs critères majeurs tout en se basant sur la localisation cellulaire, la nature du site catalytique, et selon leur besoin en ATP [16].

(25)

Tableau 1: Principales classes d’enzymes [16]

Figure 1 : Répartition du marché mondial des enzymes [4]

Classes Réactions catalytiques

Oxydoréductases catalysent les réactions d’oxydoréduction des alcools, cétones, aldéhyde….

Transférases transfèrent les groupes : monocarboné, azoté, phosphorés …

Hydrolases lysent des liaisons esters, amides, thioester en présence d’eau

Lyases permettent la formation des doubles liaisons ou l’addition des

groupements fonctionnels sur ces liaisons (C=C, C=O, C=N)

Isomérases permettent l’isomérisation-racémisation

(26)

1.1.1.1. Selon la localisation cellulaire

Les protéases sont divisées en deux groupes selon leurs sites d’action dans la cellule, soit les protéases intracellulaires et extracellulaires, les différents sous-groupes sont présentés dans le Tableau 2 [4]

Les protéases intracellulaires : Ces protéases jouent un rôle essentiel dans l’élaboration et la régulation des processus cellulaires et métaboliques, ce type de protéases est moins intéressant à l’utilisation industrielle car ces enzymes nécessitent une étape de lyse cellulaire pour en faire l’extraction.

Les protéases extracellulaires : Ces enzymes catalysent l’hydrolyse des protéines en petits peptides assimilables par les cellules. Ces enzymes sont plus intéressantes pour utilisation en industrie car elles ne nécessitent pas d’étapes de lyse cellulaire pour en faire l’extraction. 1.1.1.2. Selon la nature du site catalytique

Les protéases se différencient également selon leur mode d’action: les endopeptidases et les

exopeptidases, ces deux types de protéases sont divisés en plusieurs classes et sous classes (Tableau 2) [4]

Les exopeptidases : Ces enzymes hydrolysent les liens peptidiques du côté extrémités N ou

C-terminales des protéines. Il existe deux classes d’exopeptidases : les aminopeptidases et les

carboxypeptidases. Ces enzymes sont très peu utilisées en industrie.

Les aminopeptidases : Ce sont des exopeptidases qui agissent près de l’extrémité N-terminale des protéines. Elles libèrent ainsi un seul acide aminé, un dipeptide ou un

tripeptide. Beaucoup d’aminopeptidases sont spécifiques aux protéines ayant un résidu

méthionine en position N-terminale [4].

Les carboxypeptidases : Ce sont des exopeptidases qui agissent près de l’extrémité C-terminale des protéines. Elles libèrent ainsi un seul acide aminé ou un dipeptide. Les carboxypeptidases sont divisées en trois sous-classes, les sérines carboxypeptidases, les métallocarboxypeptidases et les cystéines carboxypeptidases, selon la nature des acides aminés présents au site actif de l’enzyme et selon leur mécanisme catalytique [4, 18].

(27)

Tableau 2: Classification des protéases [4]

Types de protéases Classes et sous-classes

Exopeptidases Aminopeptidases Peptidyle peptidases Dipeptidyle peptidases Tripeptidyle peptidases Carboxypeptidases Sérine carboxypeptidases Métallocarboxypeptidases Cystéine Carboxypeptidases Endopeptidases Protéases à sérine

Protéases cystéine ou protéases à thiols

Protéases aspartique ou protéases acides

Protéases thréonique

Protéases glutamique

(28)

Les endopeptidases : Ces enzymes sont les plus utilisées en industrie, elles sont caractérisées par leur action hydrolytique à un site spécifique de la chaine polypeptidique loin des extrémités

N et C- terminales. La présence d’un groupement amino ou carboxyl libre peut avoir un effet

répresseur sur l’activité de ces protéases [19]. Les endopeptidases sont divisées en 6 classes selon leur mécanisme catalytique et la nature des acides aminés qui se trouvent au voisinage de la liaison peptidique à hydrolyser :

Les protéases à cystéines (ou à thiol) : Ces enzymes sont très peu utilisées en industrie et sont présentes autant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. La plupart des protéases

de cette classe sont activées seulement en présence d’agents réducteurs comme la cystéine ou

l’acide cyanhydrique (Figure 2) [13]. Leur activité n’est pas affectée en présence de

Di-isopropylflurophosphate (DFP) et d’agent chélatant, mais elle est inhibée par la présence

d’agents sulfhydryles comme le p-chloromercuribenzonate (PCMB). Ces protéases ont un pH optimum d’activité se situant au voisinage de la neutralité cependant un petit nombre d’entres

elles présentent un maximum d’activité aux pH acides, La papaïne d’origine végétale, est la

seule protéase de cette famille employée de façon significative en industrie [4]

Les Métallo-protéases : Cette classe forme un groupe de protéases très variées et

contiennent un ion métallique divalent, le plus souvent le Zn2+, nécessaire à leur activité

catalytique (Figure 3) [19, 20, 21]. L’ion métallique est maintenu en place par la triade

catalytique (Histidine, Acide glutamique, Asparagine ou Lysine) et sont produites aussi bien

par les eucaryotes que les procaryotes. Les métallo-protéases sont habituellement des

protéases dites neutres, ayant un pH optimum se situant près de 7. Toutefois, certaines métallo-protéases sont alcalines, avec un pH optimum autour de 10. Les mêmes travaux de recherche ont montré que la stabilité de ces protéases augmente considérablement si des ions

Ca2+ sont ajoutés au milieu et diminue lorsque des agents séquestrant sont ajoutés [22].

Ainsi, ces protéases sont inactivées en présence d’agents chélateurs forts comme l’Ethyl

diamine tétracétique (EDTA) qui piège l’ion Zn2+. Les métallo-protéases sont produites par

plusieurs espèces d’Actinomycètes et principalement les Streptomyces [23, 24], elles sont

(29)

Figure 2: Structure en ruban d’une protéase à cystéine « la Papaïne » [20]

Figure 3 : (a) Structure tridimensionnelle d’un métallo enzyme.

(b) Présentation schématique du site active de cette enzyme avec le Glu384, His387, His383, Glu411 et Zn [21].

(30)

Les protéases aspartiques : Ces enzymes sont également connues sous le nom de protéases

acides, sont des endopeptidases dont l’activité catalytique dépend d’un résidu d’acide

aspartique présent au site actif de l’enzyme (Figure 4) [25]. Elles sont produites par les cellules animales, les moisissures et les levures, mais rarement par les bactéries. La plupart des protéases aspartiques ont une activité enzymatique élevée à de faibles pH (3 à 4). Leur masse moléculaire se situe entre 30 et 45 kDa. Ces protéases acides ne sont pas

inhibées par le DFP, PCMB, et le florure d’alpha-phénylméthylsulphonyle (PMSF).

Du point de vue industriel, ces enzymes présentent un intérêt dans les secteurs d’hydrolyse

des protéines à faible pH [16, 26].

Les protéases à thréonine : Cette nouvelle classe de protéases dépend de la thréonine dans son site actif.

Les protéases à sérines : Ces enzymes sont d’une grande importance au niveau industriel. La très grande majorité des protéases alcalines, sont des protéases de type sérine.

Ces protéases sont caractérisées par la présence d’un résidu sérine au niveau de leur site actif,

ainsi que deux résidus aspartate et histidine formant le complexe actif avec le résidu sérine (Figure 5) [27]. Elles sont présentes chez les virus, les bactéries et les eucaryotes. Les

différentes étapes impliquées dans le mécanisme d’action des protéases à sérines sont

présentées sur la figure 6 ou la réaction catalytique se fait en plusieurs étapes (Figure 6). Les protéases à sérines microbiennes ont généralement un pH optimal de 10. Ces enzymes sont inhibées par le DFP et le PMSF. Certaines protéases à sérines sont aussi inhibées par des agents thiols, comme le PCMB, à cause de la présence d’un résidu cystéine près du site actif [16, 28, 29, 30]. Certaines protéases sérines dépendent du Ca2+ pour leur stabilité.

1.1.1.3. Selon leur besoin en ATP

Un troisième critère de classement, en plus de ceux liés à la localisation cellulaire et la nature du

site catalytique, est lié au besoin ou non d’ATP pour fonctionner [31], ce groupe de protéases

comprend celles composées de plusieurs sous-unités contenant des domaines d’ATPase et des

domaines protéolytiques. Il existe des protéases qui ne peuvent être classées dans aucun de ces groupes, (exemple : les signaux peptidases des lipoprotéines) [16]. Malgré leurs larges diversités, les protéases peuvent avoir une action spécifique, ce qui a attiré l’attention pour leurs

(31)

Figure 4 : Structure en ruban d’une peptidase aspartique : la rénine et présentation de sont site

actif avec les deux résidus d’Acides aspartiques [25]

Figure 5 : Structure de la protéase à sérine « la chymotripsine » : Le groupe réactif au site actif est constitué d'une triade catalytique; la Ser 195 (l'acide aminé qui réagit avec le substrat), alors

(32)

Figure 6 : Présentation du cycle catalytique des protéases à sérine (chymotrypsine) qui se décompose en quatre étapes majeures [30].

- Réaction 1 : La sérine 195 attaque de façon nucléophile l’atome de carbone du carbonyle de la liaison pour former un intermédiaire tétraédrique (covalent).

- Réaction 2 (a) : Le tétraèdre se décompose dû à l’instabilité de la charge négative sur l’oxygène

du carbonyle alors lorsqu'il capte un proton de l’His 57. L’intermédiaire acyle-enzyme se forme par catalyse générale acide grâce à His 57 polarisé par Asp 102 du site actif.

- Réaction 2(b) : Ceci est suivi par la libération du produit amine et son remplacement par une molécule d’eau. 1 2 a 2 b 3 4

(33)

1.1.2. Marché mondial et origine des protéases

Parmi les enzymes industrielles les protéases sont les plus vendues dans le monde et occupent

plus de 65% du marché total d’enzymes (Figure 1) [32]. Les ventes mondiales des protéases

sont estimées à plus de 50 milliards euros annuellement [3, 28]. Toutefois, ce sont les protéases alcalines de détergence, actives et stables à des pH alcalins, qui occupent la plus grande partie [4,

32]. Ce marché mondial est dominé par la société Novo Nordisk-Danmark (40 %) et la société

Gist-Brocades-Hollande (20 %).

Les protéases microbiennes représentent approximativement 60 % du marché mondial des

enzymes, elles sont préférées aux enzymes d’origines animale et végétale puisqu’elles possèdent

toutes les caractéristiques souhaitables pour leurs applications biotechnologiques [34]. Ainsi, on distingue :

Les protéases bactériennes

La plupart des protéases commercialisées, essentiellement les protéases alcalines et les protéases

thermostables, sont produites par des souches du genre Bacillus et Streptomyces. Les protéases

les plus connues sont : la subtilisine (Carlsberg) produite par B lichniformis [35]utilisée dans les

détergents, La subtilisine commerciale (BPN) produite par B amyloliquefaciens [36] et la

protéase (SGPA) produite par [37, 38]. Les protéases bactériennes neutres sont actives à des pH allant de 5 à 8, elles sont faiblement thermo tolérantes et grâce à leur faible vitesse de réaction,

ces protéases génèrent moins de coproduits amères lors de l’hydrolyse des protéines

alimentaires, comparées à celles d’origine animale, d’où leur utilisation dans l’industrie

alimentaire [29].D’autre part, les protéases alcalines bactériennes telles que les kératinases, sont

caractérisées par leur importante activité à des pH alcalins, dans une zone de pH de 8 à 12 et

présentent une température optimale d’activité autour de 60°C, elles sont caractérisées par leur

large spécificité vis-à-vis des substrats. Ces différentes propriétés les rendent plus recherchées au niveau industriel [4].

Les protéases fongiques

Les champignons produisent un spectre plus large d’hydrolases que les bactéries. Ainsi,

Aspergillus oryzae produit des protéases acides, neutres et alcalines. En fait, les protéases fongiques sont actives dans une large gamme de pH (entre 4 et 11) et montrent une large spécificité vis-à-vis des substrats. Cependant, elles ont un rendement réactionnel et une thermo tolérance plus faible que les protéases bactériennes [4, 16].

(34)

Les protéases fongiques acides présentent un optimum d’activité compris entre 3 et 5 sont stables à des pH allant de 2,5 à 6. Elles sont particulièrement utilisées dans l’industrie fromagère. Les protéases fongiques neutres sont des métalloprotéases actives à un pH voisin de 7 et sont inhibées par les agents chélatants comme EDTA. Elles sont utilisées pour supplémenter l’action des protéases végétales, animales et bactériennes et pour réduire le goût amer des hydrolysats

protéiques alimentaires. Elles sont produites par plusieurs espèces telles que : Trichoderma

harzianum,Aspergillus fumigatus et Aspergillus clavatus [39, 40, 41]

1.1.3. Application des protéases en biotechnologie

Généralement les enzymes sont largement utilisées par l’industrie aussi bien dans les

biotechnologies blanches que moléculaires. Ainsi, 65% de ces enzymes sont des protéases dont les domaines d’applications sont variés. On distingue :

Industrie des détergents

Les premières enzymes fournies à cette industrie étaient les protéases, qui occupent aujourd’hui

encore une position dominante. Les protéases représentent environ 60 % des ventes mondiales d’enzymes pour les détergents ménagers et environ 50 % des enzymes pour les détergents pour lave vaisselle automatique. Ces enzymes possèdent des propriétés nettoyantes croissantes et une

grande stabilité face aux oxydants, Elles facilitent l’élimination des taches comme l’herbe, le

sang, l’œuf et la sueur. Dans les détergents pour les vaisselles, elles aident à supprimer les films d’aliments protéiques comme l’œuf et le jus de viande [42].

Industrie de tannerie

Le traitement enzymatique en tannerie est préféré aux méthodes conventionnelles qui requièrent l’utilisation de produits chimiques polluants. Cette approche présente de nombreux autres avantages, notamment, le contrôle facile et rapide du processus avec réduction des pertes [43].

En 1997 des travaux de recherches ont apporté l’utilisation de la protéase alcaline de B. subtilis

IIQDB32 pour le traitement des peaux de mouton [44], de même, en 1995 d’autres travaux ont

utilisé la protéase alcaline de B. amyloliquefaciens pour le tannage des peaux [45]. Les protéases

alcalines qui possèdent des activités élastolytiques et kératinolytiques sont très demandées dans ce type d’industrie.

(35)

Industrie agroalimentaire

Les protéases microbiennes sont traditionnellement exploitées dans différents secteurs d’industrie alimentaire. En fait, la fonction principale des protéases est l’hydrolyse protéique qui a été exploitée pour la préparation des hydrolysats protéiques de haute valeur nutritionnelle. Ces hydrolysats protéiques peuvent jouer un rôle important dans la régulation de la pression sanguine, ils sont introduits aussi dans la formulation des produits alimentaires pour nourrissons, dans des produits thérapeutiques spécifiques des régimes alimentaires et dans la fortification des jus de fruit et des boissons non alcoolisées [44].

Autres applications

Certaines protéases sont utilisées aussi en :

- Synthèse de peptides ;

- Traitement des rejets industriels ;

- Traitement de la soie ;

- Panification : Amélioration de l’élasticité de la pâte (les protéases fongiques) ;

- Industries laitière et fromagerie : Coagulation des protéines du lait et son

aromatisation;

- Brasserie : Prévention du trouble au froid de la bière par action de la papaïne ;

- Préparation des hydrolysats de protéines à usage microbiologique telles que peptone,

tryptone. 1.2. Les kératinases

1.2.1. Définition et mode d’action des kératinases

Les kératinases nommées aussi enzymes kératinolytiques représentent l’un des plus importants

groupes d’enzymes protéolytiques qui ont un grand intérêt industriel et

des applications dans différents secteurs, ces enzymes ont la capacité d’hydrolyser les kératines

efficacement que d’autres protéases. Elles ont été classées comme des protéinases de mécanisme

inconnu tel que recommandé par l’IUBMB (1978) avec le numéro [EC 3.4.21/24/99.11] [46].

Des recherches récentes ont indiqué que les kératinases sont comme les protéases à sérine en raison de leurs 97% d’homologie avec les protéases alcalines (Figure 7), et leur inhibition se fait par les même inhibiteurs des protéases à sérine, et elles peuvent être aussi des métallo-protéases [47, 48]. Ce sont des enzymes qui dégradent facilement la kératine des plumes, de laine et des cheveux ainsi que d’autres protéines fibreuses (l’élastine et le collagène) et d’autre non fibreuses

(36)

Figure 7 : Structure 3D en rubon des kératinases complexes (Le sillon du site actif, au centre, contient les résidus catalytiques) [49]

Ces enzymes kératinolytique attaquent principalement les ponts disulfures du substrat non soluble par clivage de ces derniers ce qui permet l’attaque des protéases extracellulaires et donne

en définitive une accumulation de sulfocysteine, l’excès de soufre est oxydé en sulfite et en

sulfate ou en thiosulfate qui se concentre dans le milieu réactionnel [50, 51, 52, 53] (Figure 8). Des études utilisant des substrats synthétiques ont montré que ces enzymes ont tendance à hydrolyser les liaisons peptidique au niveau de lamine des acides aminés aromatiques et hydrophobes. [54]

Réductase (kératinase) Protéase

K-S-S-K K-SH Peptide/ Acide aminé (Kératine native) (Kératine réduite) (Produit)

Cys - S - S - Cys + HS0-3 Cys - SH + Cys - SS03

(a)

(37)

1.2.2. Origine des kératinases

Les enzymes kératinolytique sont très répandues dans la nature et sont produites par un ensemble de micro-organismes qui se développent sous différentes conditions écologiques et environnementales, et ils montrent une grande capacité à dégrader les substrats kératiniques. Ces enzymes sont principalement sécrétées par une multitude de champignons, parasites

pathogènes, dermatophytes et saprophytes tel que : Aspargillus Niger, Aspargillus versicolor,

Doratomyces microsporus, Trichophyton mentagrophytes et Microsporum canis [57, 58, 59, 60]

et par des bactéries tel que le genre Streptomyce comme: Streptomyces gulbergensis,

Streptomyces thermoviolaceus [61, 62, 63]et le genre Bacillus comme: Baccillus lichenoformis,

Bacillus pumilus [17, 64, 65, 66]. Les kératinases bactériennes sont d’un intérêt particulier en raison de leur action sur un large éventail de substrats protéiques et tout particulièrement les

kératines sur lesquelles elles agissent avec un niveau d’activité très élevé [4, 67]. L’activité

kératinolytique des enzymes libérées par les micro-organismes dépendent de la nature de la souche utilisée, les propriétés du milieu de production et le mode de sécrétion [4].

Quelques exemples de travaux de recherches sur des champignons et des bactéries producteurs de kératinases ayant une activité kératinolytique et des propriétés physico-chimiques importantes sont représentés sur le Tableau 3

L’utilisation des kératinases microbiennes n’a été étudiée que récemment, les travaux de recherche et de développement sont jusqu’à présent en cours afin de créer de nouveaux produits à base de ces enzymes [68].

1.2.3. Physiologie de la production des kératinases

Les kératinases microbiennes, produites en présence d’un substrat kératinique, sont majoritairement extracellulaires et inductibles. Toutefois, une minorité sont membranaires [69, 70]. La majorité des travaux montrent que la fraction intracellulaire contient une activité disulfure réductase qui agit en synergie avec les kératinases extracellulaires pour dégrader la kératine par réduction des ponts disulfures. Donc, la kératinolyse se fait en deux étapes; une

étape de sulfitolyse ou de réduction des ponts disulfures suivi d’une protéolyse. L’étape de la

sulphitolyse ce fait soit en présence d’agents réducteurs (tels que sulfate de sodium, dithiotreitol

(DTT) et mercaptoethanol) [71] ou de disulfure réductase [72]. La coopération de l’un de ces

actes avec l’activité kératinolytique permet d’aboutir à une dégradation complète de la kératine. Cependant, la chronologie de ces événements et leurs natures exactes ne sont pas encore bien élucidée. Les kératinases sont largement produites sur milieu contenant un substrat kératinique

(38)

Tableau 3 : Les microorganismes les plus connus pour la production de kératinases hyperactives avec des propriétés physicochimiques extrêmes

Espèce Type PM(KDa) pHi pH (optimum) T (optimale) (°C) Cofacteur Références

Champignons: Chrysosporium keratinophilum Alternaria tenuissiam Aspergillus nidullans - - - - 9 8.5 7-10 8-10 90 - Fe2+ - [74] [75] Bactéries: Bacillus: B. lichineformis RPK B. subtilis KD-N2 B. pumilus B. pumilus A1 B. megaterium F7-1 Sérine Sérine Métallo-sérine - 32 65 34 - 9 8 - - 5-7 - 8-9 7-11 60 35 60 - Ca2+ - Ca2+ - [76] [77] [78] [79] Streptomyces:

S. Fradiae var K11 Alcaline 69

44 - 8.5 7-10 - 90 50 Fe2+ - [80] [81]

(39)

1.2.4. Propriété physicochimiques des kératinases

Les kératinases sont des métallos enzymes qui appartiennent à la famille des protéases à sérine

où les groupements –SH sont impliqués dans le maintien de l’activité enzymatique.

Elles ont un poids moléculaire allant de 18 à 315 kDA [77]. La kératinase la plus petite de taille

(18 kDa) est produite par S.albidoflavus K1-02 [54], et la plus grande de taille (315 kDa) est

produite par Microsporum canis [83]. L’activité kératinolytique peut être inhibée par un certain

nombre d’agents tel que PMSF et l’EDTA [84]. Par contre les ions métalliques comme le calcium et le zinc stabilisent l’activité enzymatique à des températures très élevées [85]. Ces enzymes ne sont pas glycolysée et sont généralement actives à des pH neutres et alcalins. (Tableau 4)

Les connaissances sur les protéases thermostables sont très peu approfondies et leurs modes de fonctionnements peu connus en comparaison par des protéases alcalines conventionnelles [16]. Les kératinase thermostables (et les enzymes thermostables en général) trouvent facilement leur place dans le monde industriel des enzymes en raison de leur grande activité et stabilité. Depuis quelques années, la découverte de nouvelles protéases thermostables s'est produite par l’isolement de microorganismes étant eux-mêmes résistants à des hautes températures, ces microorganismes thermophiles préfèrent des températures élevées pour leur croissance et ont donc besoin d'enzymes thermostables pour effectuer les réactions nécessaire [16]. La température optimale d’activité des kératinases s’étend de 30 à 80°C, de plus les kératinases de

Chysosporium keratinophilum et Fervidobacterium islandicum A W-1 présentent respectivement des températures optimales exceptionnelles de 90 et 100°C [70]. Une haute thermostabilité

(90min à 100°C) a été mentionnée pour la kératinase produite par F.islandicum A W-1 [70].

Les kératinases sécrétées par les Actinomycètes présentent un maximum d’activité à un large

éventail de pH compris entre 7 à 12 et résistent à des températures très élevées allants de 55 à

90°C tel que, la kératinase produite par Thermoanaerobacter keratinophilus qui présente une

stabilité pendant 6h à 80°C. Il est indiqué aussi que la stabilité thermique de ces enzymes augmente en présence de calcium [86, 87, 88]

Figure

Figure 4 :  Structure en ruban d’une peptidase aspartique : la rénine et présentation de sont site
Tableau 3 : Les microorganismes les plus connus pour la production de kératinases hyperactives avec des propriétés physicochimiques extrêmes
Figure 9 :  Représentation schématique de l’organisation de la protofibrille de la structure  primaire de l’α-kératine de la chevelure humaine [33, 96]
Tableau 5 : Concentration des acides aminés en gramme par Kg de plumes [71]
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