OBJECTIFS DU TRAVAIL DE THESE

Malgré les efforts effectués pour comprendre les déterminants du phénotype épileptique des patients qui portent les mutations sur Cavβ4, les effets moléculaires de ces mutations demeurent inconnus.

Deux mutations humaines ont été enregistrées dans le gène CACNB4 codant pour Cavβ4, chez des patients atteints d’une épilepsie idiopathique générale, d’une épilepsie juvénile myoclonique (JVM) et d’une ataxie convulsive. La première mutation, issue d’une terminaison prématurée (R482X) génère une protéine tronquée de 38 acides aminés du coté carboxy-terminal. La deuxième est une mutation ponctuelle, résultant en la substitution d’une cystéine par une phénylalanine (C104F). En système d’expression hétérologue, les mutants n’ont pas un effet remarquable sur la régulation biophysique et l’adressage moléculaire du canal, par rapport à la sous-unité Cavβ4 sauvage (Escayg et al., 2000) ; en co-expression avec la sous-unité Ca_v2.1, les mutants de Ca_vβ4 sont toujours capables d’interagir avec le canal et d’assurer sa modulation. De plus, des interactions secondaires ont été identifiées entre l’extrémité carboxy-terminale de la sous-unité Ca_vβ4 et les extrémités carboxy et amino-terminales de la sous-unité Ca_v2.1 (Walker et al., 1998; Walker et al., 1999), et dans le cas du mutant R482X, une perte éventuelle de ces interactions pourrait également influencer la régulation biophysique du canal. Ainsi, ce phénotype neurologique n’est pas du à une altération de l’activité du canal mais probablement à d’autres fonctions propres à la sous-unité Cavβ4.

Durant les deux dernières décennies, la sous-unité Cavβ était considérée comme étant uniquement le partenaire de la sous-unité Ca_vα₁ et son modulateur biophysique majeur qui gouverne la densité et les cinétiques d’activation et d’inactivation du courant calcique. Aujourd’hui, d’autres fonctions ont été révélées et attribuées spécifiquement à la sous-unité Cavβ.

La première étape, après la caractérisation de l’effet biophysique des Cavβ sur le canal (Birnbaumer et al., 1998; De Waard et al., 1994; De Waard et al., 1996), ainsi que l’adressage membranaire de la sous-unité Cav^α1 par Cavβ (Bichet et al., 2000), était

l’identification de nouveaux partenaires spécifiques à la sous-unité Ca_vβ : les membres de la famille RGK (Rem-Gem-Kir), des protéines G (GTPases) de petites masses moléculaires. Ces protéines interagissent directement avec la sous-unité Ca_vβ afin de moduler l’expression des canaux à la surface membranaire, en séquestrant les Cavβ dans le cytoplasme, et même dans le noyau (Beguin et al., 2006; Beguin et al., 2001; Chen et al., 2005; Finlin et al., 2006).

La résolution tridimensionnelle de la sous-unité Cavβ a exposé substantiellement l’interaction du domaine AID de la sous-unité Cav^α1 avec l’ABP (AID binding pocket), un creux hydrophobe présent dans le domaine GK (guanylate kinase). La structure cristallographique révèle que cette interaction nécessite peu d’éléments structuraux de la sous-unité Cavβ permettant ainsi de conserver une large place à d’autres interactions moléculaires (Chen et al., 2004; Opatowsky et al., 2004; Van Petegem et al., 2004). Cette structure révèle également le point de ressemblance structurale entre les sous-unités Cavβ

et les protéines de la famille MAGUK (membrane-associated guanylate kinase), suggérant un rôle similaire pour la sous-unité Ca_vβ dans l’échafaudage protéique au niveau membranaire.

La première démonstration d’une fonction propre à Ca_vβ, donc indépendante de la régulationdu canal, est l’étude réalisée sur un variant de Ca_vβ4 exprimé dans la cochlée du poulet (Hibino et al., 2003). Ce variant, tronqué dans son domaine GK, est capable d’interagir avec une protéine nucléaire (HP1 heterochromatin protein), de se transloquer dans le noyau et par la suite de réguler le niveau de transcription génique. Une autre étude suggère également un rôle de la sous-unité Cavβ3 indépendant de la sous-unité Cav^α1. Dans les cellules β pancréatiques, Cavβ3 inhibe la sécrétion d’insuline à des fortes concentrations de glucose. Ce mécanisme est loin d’être complètement élucidé (Berggren et al., 2004).

Ces études soulèvent une interrogation sur la divergence des fonctions des unités auxiliaires des canaux calciques dépendants du voltage en général, et des sous-unités Cavβ en particulier, ainsi que sur la disponibilité de ces sous-unités qui sont, à

priori, engagées dans la formation et la régulation des complexes calciques.

Ca_vβ des canaux, après l’adressage membranaire des sous-unités Ca_vα₁ (Restituito et al., 2001; Sandoz et al., 2004). L’interaction Cav^α1/ Cavβ semble réversible, un processus possible une fois le canal à la membrane (Hidalgo et al., 2006). Par conséquent, les sous-unités Cavβ seraient également disponibles librement dans le cytoplasme ou le noyau.

Toutes ces démonstrations indiquent que les sous-unités Cavβ ont une activité à temps partiel dans la régulation des canaux calciques, qui peut être complétée par des fonctions différentes. Cela nous a incité à penser que le phénotype neurologique sévère des patients, portant la mutation sur la sous-unité Cavβ4, est du à une fonction neuronale critique, probablement indépendante de la régulation du canal calcique. Cette fonction est clairement confirmée par un modèle de souris, où l’absence de la sous-unité Cavβ4 induit également un phénotype neurologique.

La souris léthargique est un modèle naturel déficient en sous-unité Cavβ4. L’absence de la sous-unité Ca_vβ4 provient d’une insertion spontanée de 4 nucléotides engendrant un décalage du cadre de lecture de la protéine. Cette souris souffre d’une ataxie et d’une épilepsie. On ignore pour l’instant comment l’absence de cette sous-unité peut aboutir à un tel phénotype assez marqué (Burgess et al., 1997). En fait, le manque d’expression de la sous-unité Ca_vβ4 semble être compensé partiellement par l’expression des autres isoformes. Il est évident que cette compensation ne parvient pas à substituer les fonctions critiques de la sous-unité Ca_vβ4 dans le cerveau (Burgess et al., 1999).

Dans ce contexte, l’objectif de mes travaux de thèse était la recherche d’une nouvelle fonction de la sous-unité Cavβ4 dans les neurones, qui pourrait être impliquée dans l’épilepsie. Des analyses de localisation de la Cavβ4 dans les neurones d’hippocampe durant la différenciation ont été faites, ainsi qu’une étude sur les déterminants structuraux influençant cette localisation. Je me suis contentée d’étudier également la mutation humaine (R482X), en réalisant une analyse comparative avec la sous-unité Cavβ4 native, dans le but d’identifier les déterminants moléculaires et les fonctions neuronales déficientes responsables du phénotype neurologique exprimé chez les patients.

Diverses techniques ont été déployées dans cette étude ; la biologie moléculaire, les cultures des neurones primaires, l’immunocytochimie, l’immunohistochimie, la microscopie confocale, la biochimie, la transcriptomique ainsi que l’électrophysiologie.

Figure 16

Figure 16 : Les variants d’épissage de la sous-unité Cav

β

β

Cavββββ4b N----ter^NNNter terter SH3 GK CC----terCCterter ter

SH3 GK

N NN

N----terterter ter CC----terCCterter ter

Caϖβϖβϖβϖβ4 519 519 519 519 486 486486 486