Objectifs et plan du travail
Les champs d’investigation décrits en thérapie tissulaire cardiaque sont très captivants et prometteurs mais suscitent cependant un nombre appréciable de questions. On ne connaît pas encore la nature ni le phénotype des cellules d’origine médullaire, de type CSH, CSM ou de type PE, impliquées dans les phénomènes de réparation cardiaque par transdifférenciation. Les méthodes idéales de prélèvement, sélection, amplification et transplantation de ces cellules à potentialité réparatrice restent également mal définies. D’autre part, le G-CSF est une cytokine puissante dont il a été démontré qu’elle pouvait améliorer la fonction et la perfusion cardiaque après un infarctus du myocarde, non seulement en mobilisant les CS de la MO, mais également en exerçant des effets cardioprotecteurs directs. Toutefois, des études complémentaires sont requises afin de clarifier l’intérêt d’un traitement complémentaire par du G-CSF chez les patients souffrant d’infarctus aigu du myocarde.
L’objectif général du travail était d’optimaliser les protocoles de thérapie cellulaire de réparation cardiaque après infarctus du myocarde expérimental, et en particulier d’étudier les modalités idéales d’utilisation du G-CSF dans ce type de modèle.
Notre laboratoire possédant déjà l’expérience requise relative à la sélection et la culture ex vivo de CSH, nous avons dans la première partie de notre travail, défini les conditions de culture optimales pour CSMh et CSMm. Nous avons alors caractérisé ces cellules des points de vue croissance et cycle cellulaire, fonctionnalité et phénotype. Nous avons également vérifié si les CSM amplifiées ex vivo ont toujours la capacité de se différencier in vitro en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes, mais surtout en cardiomyocytes. Nous avons ensuite vérifié l’expression de la GFP dans les CSMm afin de greffer ultérieurement ces cellules facilement identifiables par leur fluorescence, chez des animaux souffrant IM.
Les modèles animaux sont fréquemment utilisés pour étudier les mécanismes physiopathologiques cardiaques et tester les nouvelles stratégies thérapeutiques. Les modèles murins présentent de nombreux avantages ; toutefois, l’évaluation de la fonction cardiaque reste plus difficile d’accès que chez les gros animaux. La seconde partie du travail a consisté à mettre au point un modèle d’infarctus du myocarde par occlusion de l’artère coronaire chez la souris. Ce modèle animal sera utilisé pour évaluer l’impact du G-CSF sur la fonction cardiaque. Parallèlement, nous avons également développé des techniques d’histologie et
d’immunohistologie qui permettront d’analyser la régénération tissulaire cardiaque après mobilisation de CS par du G-CSF. Deux anticorps dirigés contre l’αactinine et la connexine 43 marquent les cardiomyocytes de façon spécifique. La connexine 43 permet plus précisément de mettre en évidence les connexions entre cellules cardiaques. Un anticorps monoclonal dirigé contre l’antigène CD31 nous permet de mettre en évidence l’angiogenèse. Afin de compléter l’étude de la perfusion cardiaque, nous avons eu recours à un nouveau système d’imagerie par SPECT. Au vu de l’intérêt croissant pour l’utilisation du SPECT afin de déterminer la taille de l’infarctus dans des modèles murins de pathologies cardiovasculaires, nous avons développé un protocole d’imagerie par SPECT in vivo afin d’estimer la perfusion myocardique chez la souris ; nous avons ensuite validé cette méthode par la comparaison des mesures obtenues à celles de la taille de l’infarctus du myocarde par histologie. Nous avons enfin mis au point des techniques échographiques et de sonde à conductance chez la souris afin de pouvoir évaluer l’évolution des paramètres hémodynamiques cardiaques dans notre modèle murin d’IM.
Avant d’évaluer la contribution du G-CSF aux phénomènes de réparation du tissu cardiaque lésé suite à une diminution de la perfusion, nous avons tout d’abord, dans la 3ème
partie de notre travail, étudié la capacité du G-CSF à mobiliser les CSH, CSM et PE chez des
souris saines. Nous avons voulu évaluer la cinétique de mobilisation des cellules progénitrices ainsi que l’impact sur la MO de souris injectées quotidiennement pendant 1 à 10 jours par du G-CSF. La capacité clonogénique des CS de la MO et du SP chez ces souris à également été estimée. Nous voulions également vérifier l’impact d’un traitement par du G-CSF sur la perfusion et les performances du muscle cardiaque d’une souris saine. A notre connaissance, l’effet de l’administration du G-CSF sur la perfusion cardiaque dans un cœur normal n’a jamais été étudié.
Nous avons ensuite mis au point, chez trois sujets sains mobilisés par du G-CSF ou de l’EPO, l’analyse par FACS des cellules progénitrices ainsi que les essais fonctionnels de formation de colonies, qui permettront d’évaluer la cinétique de mobilisation de ces cellules dans le SP.
L’objectif de cette partie du travail est de tenter de déterminer le timing le plus approprié pour l’administration du G-CSF: non seulement, pour améliorer la collecte par aphérèse des 3 types de cellules progénitrices, mais également, pour établir le meilleur protocole pour l’usage du G-CSF en thérapie cellulaire.
Enfin, dans la 4ème partie de notre travail, nous avons examiné si la survenue d’un infarctus du myocarde pouvait affecter la mobilisation de cellules progénitrices dans le SP et la MO et avons par la suite étudié la contribution du G-CSF à la réparation du tissu cardiaque dans notre modèle murin de ligature de l’artère coronaire. L’impact sur la survie, la fonction hémodynamique cardiaque et la perfusion de deux schémas de traitement par du G-CSF ont été étudiés par l’usage complémentaire de l’échographie Doppler, l’imagerie « strain » 2- dimension non-Doppler, l’évaluation hémodynamique à partir de boucles pression-volume et l’imagerie µSPECT. Pour ce faire, les animaux ligaturés sont administrés journalièrement par du G-CSF, soit pendant 5 jours après l’infarctus, soit pendant 5 jours avant et 5 jours après la chirurgie. Une semaine après l’induction de l’IM, les modifications fonctionnelles et structurelles induites par l’infarctus et le traitement au G-CSF sont évaluées.
Nous avons enfin évalué, de façon préliminaire, l’effet dans notre modèle murin d’IM de l’administration de VEGF classique ou d’une molécule de VEGF délétée de son exon 5, qui la rend résistante à la protéolyse induite par la plasmine.