de CSM afin d’évaluer leur capacité de régénération tissulaire cardiaque dans un modèle murin.

1.1. Objectifs du travail et méthodes

Notre laboratoire possède déjà l’expérience requise relative à la sélection et la culture

ex vivo de CSH. Par contre, la première étape de ce travail a consisté à mettre au point les

conditions d’isolement et d’expansion ex vivo des CSM. Brièvement, les cellules mononuclées de moelle osseuse de souris transgéniques pour le gène codant pour l’eGFP et de moelle osseuse de donneurs volontaires sont isolées par gradient de densité. Elles sont cultivées ex vivo dans un milieu complet approprié, avec entretiens successifs de la fraction adhérente et épuisement progressif des cellules non adhérentes. Le nombre de semaines en culture ex vivo et de passages sont déterminés afin d’amplifier les CSM à un haut degré de pureté.

L’expansion des CSM sera évaluée selon différents paramètres : a) Enumération de la fraction adhérente et analyse du cycle cellulaire.

b) Analyse du phénotype des cellules cultivées ex vivo par cytométrie en flux. c) Evaluation de la richesse en progéniteurs CFU-F.

d) Différenciation fonctionnelle des CSM in vitro.

Nous désirons vérifier si les CSM amplifiées ex vivo ont toujours la capacité de se différencier in vitro en cardiomyocytes. Pour cela, le milieu de culture de différenciation est supplémenté de 5-azacytidine et la mise en évidence de protéines propres au muscle cardiaque, telles que l’alpha-actine et la connexine 43, est obtenue par méthode immunohistochimique. Le phénotype de ces cellules ainsi que leur capacité clonogénique et de différenciation, sont évalués de façon similaire aux CSM indifférenciées.

Afin de déterminer la capacité des CSM à participer aux phénomènes de réparation tissulaire cardiaque, nous devons être en mesure de les détecter après qu’elles aient été injectées. C’est pourquoi, nous avons ensuite vérifié l’expression de la GFP dans les CSMm isolées à partir d’une lignée de souris transgéniques exprimant ubiquitairement ce fluorochrome.

1.2. Résultats

1.2.1. Isolement et expansion de CSM humaines et murines in vitro

L’adhésion primaire des cellules mononuclées humaines dépend du lot de FBS utilisé (Fig16A.). De plus, une meilleure amplification cellulaire est obtenue dans le milieu MSCGM par rapport au milieu DMEM-LG supplémenté par 10% du FBS, quel qu’en soit le lot. Une densité cellulaire de 500.000 cellules par cm2 à partir des cellules de moelle et de 5.000 cellules par cm2pour les passages ultérieurs permet une multiplication cellulaire optimale.

Les CSM (Fig 16B.) sont plus difficiles à isoler et à amplifier que les CSM humaines. Nous avons dû tester différents milieux de culture et définir la composition optimale et la densité cellulaire requises pour obtenir une bonne expansion des CSM murines. Le milieu idéal consiste en du DMEM avec 10% FBS, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine. Quant à la densité cellulaire optimale, elle est de 800.000 cellules/cm2à partir des cellules de moelle, de 40.000 cellules/cm2 aux passages 1 à 5 et de 10.000 à partir du 6ème passage. Les passages successifs assurent l’entretien de la fraction adhérente et l’épuisement progressif des cellules non adhérentes. Au 7èmepassage, les CSM seront amplifiées à un haut degré de pureté.

Figure 16 : A. CSM humaines cultivées dans du MSCGM et B. CSM murines cultivées dans du DMEM+10% FBS à un grossissement de 40 X.

Une courbe de croissance a pu être tracée et le temps de doublement calculé est de 8 jours (Fig. 17A). Aucune phase de décroissance ne peut être observée jusqu’au 15èmepassage, ce qui se rapproche des courbes de croissance observées pour les lignées continues. Nous avons également comparé la croissance des CSM cultivées à une densité cellulaire élevée ou faible (Fig. 17B et C) et avons pu constater que le meilleur rendement d’amplification est obtenu pour les concentrations cellulaires les plus élevées.

0,0E+00 5,0E+07 1,0E+08 1,5E+08 2,0E+08 2,5E+08 3,0E+08 3,5E+08 4,0E+08 4,5E+08 1 2 3 4 5 6 7 8 Passages N b r to ta l d e c el lu le s

Figure 17 : A. Courbe de croissance obtenue au cours des passages successifs des CSM murines. B. Courbe de croissance obtenue en P1 pour des densités cellulaires de 100 et 100.000 cellules/cm2. C. Courbe de croissance obtenue en P3 pour des densités cellulaires de 1.000 et 10.000 cellules/cm2.

1.2.2. Analyse des CSM par cytométrie de flux

D’un point de vue morphologique, nous avons pu constater, lors des passages des CSM au FACS, l’apparition d’une population cellulaire de grande taille, de haute densité et non présente immédiatement dans la moelle. Il a effectivement été reporté que les CSM ont une morphologie particulière et qu’il est possible de les isoler d’après le seul critère de la taille. Nous avons appelé cette population supérieure, population de CSM FSChigh SSChigh (Fig. 18). C’est pourquoi, lors de nos analyses du phénotype en cytométrie de flux, nous

…

enregistrons les résultats pour l’ensemble des cellules, mais également, pour la population FSChigh SSChigh et avons observé qu’elle présente plus rapidement le phénotype attendu pour les CSM (Tableau 4).

Figure 18 : Analyse par FACS de la population de CSMm FSChigh_SSChigh_{. FSC est un paramètre représentant la} taille des cellules et SSC la granularité.

Nous avons ensuite analysé le phénotype des cellules mononuclées de la moelle humaine par cytométrie de flux (Tableau 4). Les cellules sont négatives pour les antigènes CD34, CD80, CD105, CD73 et CD90. Les antigènes HLA-I et –II présentent respectivement une positivité de 71.9% et 22.33%. Les cellules mononuclées de la moelle sont également positives pour les marqueurs hématopoïétiques CD45 (77.0%) et CD31 (39.8%). Au deuxième passage, nous obtenons déjà le phénotype décrit pour les CSM humaines. En effet, on peut observer que les antigènes attendus négatifs le sont effectivement (CD31, CD34, CD45, CD80, HLA-DR), alors que les antigènes HLA-1, CD73, CD90 et CD105 sont fortement positifs.

Tableau 4 : Etude de l’expression des antigènes de surface des cellules mononuclées de la MO et des CSM humaines en culture après 2 passages (P), dans la population totale ou dans la population de CSMm FSChighSSChigh.

P0 P2

Population totale FSChighP2_SSChigh Marqueurs hématopoïétiques CD34 4.7% 0.9% 0.2% CD45 77.0% 0.9% 0.2% Marqueurs endothéliaux CD31 (PECAM) 39.8% 1.9% 1.8% CD90 (Thy1) 0.0% 92.2% 92.8% Marqueurs spécifiques CSM HLA-1 71.9% 79.3% 92.6% CD73 0.0% 84.5% 92.8 CD105 0.0% 71.1% 83.6% Autres marqueurs CD80 4.0% 0.0% 0.0% HLA-DR 22.3% 0.5% 0.0%

En étudiant l’expression de différents antigènes à la surface des cellules de la moelle murine ainsi qu’au cours des différents passages des CSM de souris en culture, nous pouvons observer que l’expression des marqueurs CD45 et 11b (Fig. 19A.) est élevée dans la moelle et diminue fortement au fur et à mesure des passages, jusqu’à être inférieure à 5%. L’antigène CD34 (Fig. 19A.) quant à lui, reste faiblement exprimé tout au long des passages. Les antigènes CD106 et Sca-1 (Fig. 19B.) sont très faiblement détectés dans la moelle et augmentent fortement, jusqu’à plus de 95% au 8èmepassage dans la population supérieure. Ce phénotype correspond à l’expression des antigènes attendus pour les CSM murines. Le tableau 5 résume l’ensemble des antigènes analysés pour caractériser les CSM humaines et murines.

Figure 19 : Evolution de l’expression A. des antigènes attendus négatifs chez les CSM murines et B. des antigènes attendus positifs chez les CSM murines, pour l’ensemble des cellules et pour la population FSChighSSChigh.

Marqueurs hématopoïétiques