Le processus de la traduction fait intervenir de nombreux acteurs : ribosome, ARNm, ARNt et protéines. L’expression optimale et correcte des protéines nécessite entre autre une régulation très précise de ces acteurs. La traduction des ARNm en protéines se décompose en plusieurs étapes : initiation, élongation, terminaison de la traduction et recyclage du ribosome. Trm112 est une petite protéine qui interagit et est nécessaire à l’activation de quatre MTases : Mtq2, Bud23, Trm11 et Trm9. Les complexes binaires formés entre Trm112 et chacune des 4 MTases sont impliqués dans différentes étapes de la traduction :
Le complexe Mtq2-Trm112 méthyle le facteur de terminaison de la traduction eRF1 sur la chaine latérale de la glutamine du motif GGQ universellement conservé.
Le complexe Bud23-Trm112 méthyle la guanosine en position 1575 de l’ARNr 18S. Ce complexe est nécessaire pour la maturation de l’ARNr 18S de la petite sous-unité du ribosome chez la levure mais aussi chez l’Homme.
Le complexe Trm11-Trm112 méthyle la guanosine en position 10 de nombreux ARNt chez la levure et participerait ainsi à la stabilité des ARNt.
Le complexe Trm9-Trm112 catalyse la méthylation de l’uridine en position 34 de la boucle anticodon de certains ARNt. Cette méthylation permet une fidélité de lecture de
codons spécifiques particulièrement présents dans les gènes codant pour les protéines impliquées dans la réponse aux stress génotoxiques (RNR1, RNR3…).
Malgré leur faible identité de séquences, ces 4 MTases adopteraient le même repliement tridimensionnel et seraient en compétition pour interagir avec Trm112. Celle-ci semble donc être un acteur central impliqué dans les différentes étapes de la traduction.
A mon arrivée au laboratoire, la structure cristallographique du complexe Mtq2-Trm112 lié à la SAM avait été résolue, révélant la manière dont Trm112 interagit, active et stabilise Mtq2. En se basant sur la structure du complexe Mtq2-Trm112, le complexe Trm9-Trm112 avait été modélisé. L’étude de mutants de Trm9 prédits pour se situer à l’interface avec Trm112 avait renforcé l’hypothèse que Trm112 interagirait de manière similaire avec les quatre MTases et agirait en tant que plateforme d’activation.
O bjecti fs de la th èse
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Au départ, l’objectif de mon projet de thèse était d’étudier par des approches génétiques, structurales et biochimiques les complexes Trm9-Trm112 et Trm11-Trm112 et les complexes qu’ils forment avec leurs substrats, ainsi que de comparer les modes d’interactions entre Trm112 et ces 4 MTases partenaires.
A la vue des premiers résultats obtenus, la majeure partie de mon projet a finalement visé l’étude précise du complexe Trm9-Trm112 chez la levure Saccharomyces cerevisiae (Sc).
Le but de ce travail était de résoudre la structure tridimensionnelle du complexe et d’en cartographier le site actif à l’aide d’approches in vitro (tests enzymatiques, tests de liaison aux substrats) et in vivo (phénotype de résistance à la zymocine, co-immunoprécipitation). L’analyse de l’effet des différentes mutations avait pour but de discriminer les mutants catalytiques ou du site de fixation de la SAM et les mutants empêchant la formation du complexe Trm9-Trm112 et ainsi de proposer le rôle des résidus dans le mécanisme enzymatique.
La résolution de la structure cristallographique de Trm9-Trm112 de la levure Yarrowia lipolytica (Yl) m’a amené à comparer ce complexe à celui de Sc. YlTrm9 possède 59% d’identité de séquence avec ScTrm9 et dans le but d’étudier l’interaction de ScTrm112 avec YlTrm9 une analyse de complémentation a été réalisée in vivo chez Sc.
Par ailleurs, il a été montré que la souche de Sc délétée pour le gène TRM9 présente un phénotype de croissance ralentie en présence de certaines drogues endommageant l’ADN. L’étude de Trm9-Trm112 visait également à évaluer les souches mutantes pour leur comportement vis-à-vis de ces drogues.
Une deuxième partie de mon travail de thèse s’est portée sur l’analyse de l’interaction de Trm112 avec ses partenaires qui partagent moins de 20% d’identité de séquence. Dans le but de comprendre le mécanisme d’action de Trm112 et la régulation de cette plateforme d’activation, deux aspects ont été étudiés au cours de ma thèse.
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Dans ce contexte, l’analyse structurale et fonctionnelle du complexe Bud23-Trm112 a été mise en œuvre afin de comparer les modes d’interaction entre les différents complexes. L’étude fonctionnelle de ce complexe a été réalisée par nos collaborateurs (Valérie Heurgué-Hammard et Denis Lafontaine).
Enfin, la dernière partie de mon travail de thèse a consisté à étudier la présence de Trm112 chez les Archaea, ceci à travers une analyse biochimique du complexe Trm9-Trm112 d’Haloferax volcanii et une étude des souches de Haloferax volcanii délétées de certains gènes codant pour les possibles MTases du réseau d’interaction de Trm112.
R
R é s u l t a t s & D i s c u s s i o n – 1
Figure 57 : Alignement des séquences de
Figure 58 : Analyse SDS
Les bandes encadrées ont été analysées en spectrométrie de masse, les flèches vertes et rouges indiquent les bandes correspondant à
est marquée d’une étoile (*).
P a r t i e
: Alignement des séquences de ScTrm9 et YlTrm9
: Analyse SDS-PAGE de la dégradation du complexe YlTrm9
Les bandes encadrées ont été analysées en spectrométrie de masse, les flèches vertes et rouges indiquent les bandes correspondant à YlTrm9 et à YlTrm112, respectivement.
Trm9.
Trm9-Trm112
Les bandes encadrées ont été analysées en spectrométrie de masse, les flèches vertes et rouges La bande majoritaire
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