ETUDE DE COMPLEMENTATION

Etant donnée l’homologie de séquence de 59% entre YlTrm9 et ScTrm9 et l’utilisation aisée de la zymocine pour tester l’activité Trm9-Trm112, une étude a été réalisée afin de déterminer si le gène YlTRM9 pouvait complémenter chez Sc la délétion du gène ScTRM9. L’objectif était de déterminer si dans des conditions identiques in vivo, YlTrm9 pouvait interagir avec ScTrm112 et d’estimer l’activité enzymatique éventuelle de YlTrm9 chez Sc.

2.2.1. Construction des souches pour l’étude de complémentation

Dans cette optique, la construction des souches a visé à remplacer le gène ScTRM9 par le gène YlTRM9 en utilisant les caractéristiques du marqueur d’auxotrophie URA3 selon les techniques adaptées de Storici et al, 2001 et Gray et al, 2004.

Le gène URA3 présent sur le chromosome V chez Sc code pour la Orotidine 5’-phosphate décarboxylase (ODCase) qui catalyse une des réactions de la synthèse des ribonucléotides pyrimidines. L’inactivation de cette enzyme provoque un défaut de croissance de la souche en absence d’uracile ou d’uridine. La souche YPH499 est ura3^-, sa croissance nécessite donc la présence d’uracile dans le milieu de culture. L’insertion du gène URA3 dans le génome de la souche YPH499 restaure l’activité de l’ODCase et permet de sélectionner les souches ayant intégré le gène URA3 sur milieu sans uracile.

R é s u l t a t s & D i s c u s s i o n – 1

Figure 83 : Schématisation de la stratégie de construction des souches de complémentation

P a r t i e

: Schématisation de la stratégie de construction des souches de complémentation : Schématisation de la stratégie de construction des souches de complémentation.

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Dans le cas de la construction de la souche

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trm9::URA3, la souche sauvage YPH499 a été transformée avec le produit PCR de la cassette contenant le gène URA3 flanqué des séquences

homologues aux séquences immédiatement en amont et en aval du gène ScTRM9. La sélection

sur milieu minimum sans uracile permet d’isoler des clones ayant intégré la copie sauvage du gène URA3 (figure 83). L’intégration de la cassette par double recombinaison homologue peut se produire à deux endroits dans le génome de Sc : au locus URA3 ou au locus TRM9. Un crible PCR sur l’ADN génomique des clones sélectionnés utilisant des amorces situées en amont et en aval du gène ScTRM9 a permis de valider l’insertion de la cassette URA3 à l’endroit désiré en se basant sur la modification de taille du fragment amplifié lors du crible PCR. On dispose alors de la souche YPH499

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trm9::URA3.

Par ailleurs, l’ODCase convertit une molécule inoffensive, l’acide fluoroorotique (5FOA), en 5-fluorouracile qui est un composé toxique entrainant la mort cellulaire. En présence exogène de 5FOA, seules les souches déficientes en ODCase (ura3-) sont viables sur milieu minimum contenant de l’uracile. Il est donc possible de forcer une souche URA3 à devenir ura3^-. Afin de construire la souche

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trm9::YlTRM9, la souche

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trm9::URA3 a été transformée avec le produit PCR du gène YlTRM9 flanquée des séquences homologues aux séquences immédiatement en amont et en aval du gène ScTRM9. Après transformation, les clones ont été sélectionnés sur milieu minimum complet en présence de 5FOA afin de maintenir en vie les cellules devenues

ura3^- après l’événement de double recombinaison souhaitée (figure 83). Une première vérification de l’insertion du gène YlTRM9 en remplacement du gène ScTRM9 est réalisée par PCR de la même manière que précédemment. Cette analyse est rendue possible du fait que les gènes issus de Yl et de Sc sont de tailles différentes. Enfin, un séquençage des produits PCR permet de valider définitivement la construction de la souche

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trm9::YlTRM9.

La fréquence des évènements de recombinaison à l’endroit désiré est plus faible que celle observée lors des constructions des souches précédemment décrites (15%). Ceci peut s’expliquer par le fait que la cassette URA3 peut aussi s’insérer à son locus d’origine et ainsi défavoriser la délétion d’intérêt.

Rés ulta ts & D is cus s io n – 1 P art ie

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La construction d’une souche

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trm112::YlTRM112 n’a pas été réalisable du fait que la délétion du gène ScTRM112 entraine un défaut de croissance sévère qui rend très difficile la sélection

des clones en présence de 5FOA. Le gène YlTRM112 a donc été cloné dans un plasmide

pESC-URA en aval d’un promoteur inductible au galactose afin d’exprimer YlTrm112 chez Sc. Les différentes souches ont alors été transformées avec le plasmide qui est maintenu dans la cellule par pression de sélection sur milieu minimum dépourvu d’uracile.

2.2.2. Test de résistance à la zymocine par effet dose

Dans le but d’évaluer la complémentation de ScTRM9 par YlTRM9, des tests de résistance à la zymocine ont été réalisés. Cependant, il n’était pas possible de mettre en place facilement le test d’éclipse car l’analyse pour certaines souches devait se dérouler en absence d’uracile, conditions non favorables à la croissance des souches de Kluyveromyces lactis(Kl). Par conséquent, des tests zymocine par effet dose ont été mis en place. Les souches « killer » et « non killer » de Kl sont mises en culture en milieu riche avec du galactose comme source de carbone. Les surnageants de ces cultures représentent respectivement la source de zymocine et le contrôle négatif. Ceux-ci sont dilués de 10^-1 à 10^-4 dans un milieu synthétique minimum avec ou sans uracile et avec du galactose comme source de carbone. Chaque série de dilutions est inoculée avec la souche à tester afin d’avoir une absorbance à 600 nm de 0,1 au début de l’expérience. Après 20 heures à 30°C, la différence de densité optique à 600nm entre les dilutions 10^-4 et 10^-1 permet de comparer chaque souche vis-à-vis de leur sensibilité à la zymocine.

Cette mise en œuvre a permis de détecter des phénotypes intermédiaires et de les quantifier de façon relative. En effet, les souches

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trm9 ::YlTRM9 + pYlTRM112/pScTRM112 présentent 50% de sensibilité à la zymocine. Les résultats de cette expérience font l’objet de l’article du paragraphe 3.

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Dans le document Etudes structurales et fonctionnelles de complexes entre Trm112 et différentes méthyltransférases impliquées dans la traduction (Page 173-177)